# 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应

>  上一次介绍了[使用Seurat 的merge函数来合并4个样本（各有2个生物学重复）的8组数据](https://jieandze1314.osca.top/05/5.5-duo-ge-shu-ju-ji-de-zheng-he/5.5.1-shi-yong-seurat-de-merge-gong-neng-jin-hang-zheng-he)，但是merge只是将原始数据简单混合起来，谁也不知道混合后的结果是不是引入了批次效应

关于去除多组数据中的批次效应，有多种算法，如Seurat包的CCA(canonical correlation analysis)、LIGER的NMF(non-negative matrix factorization)、[Scran包的mnnCorrect](https://www.jianshu.com/p/b7f6a5efed85)、Seurat包的sctransform

这次就来看看sctransform是如何使用的

### 前言

> 目前教程更新于**2020-04-17**

<https://satijalab.org/seurat/v3.1/sctransform_vignette.html>

它的开发者曾说：

![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2019-10-10-000422.png)

**还支持管道单行命令：**

![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2019-10-10-000533.png)

[之前利用常规流程处理](https://jieandze1314.osca.top/05/5.3-seurat-de-shi-yong/5.3.1-seurat-v3-shi-zhan-zhi-2700-pbmcs-fen-xi)，得到的UMAP结果是：

![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2019-10-10-005933.png)

### 现在再使用sctransform看看结果

**第一步：加载10X原始数据，创建对象**

```r
# 原始数据在：https://s3-us-west-2.amazonaws.com/10x.files/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz
pbmc_data <- Read10X(data.dir = "./filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc_data)
```

**第二步：记录线粒体信息，一会进行校正**

```r
pbmc <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-", col.name = "percent.mt")

pbmc <- SCTransform(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt", verbose = FALSE)
```

* 别看SCTransform只有一个单独的函数，其实它做了：`NormalizeData` 、`ScaleData`、`FindVariableFeatures` 的事情，并且也支持`ScaleData的vars.to.regress`
* 运行的结果存储在：`pbmc@assays$SCT)` 或者`pbmc[["SCT"]]`

  ```r
  > dim(pbmc@assays$RNA)
  [1] 32738  2700
  > dim(pbmc@assays$SCT)
  [1] 12572  2700
  > pbmc@assays$SCT
  Assay data with 12572 features for 2700 cells
  Top 10 variable features:
   S100A9, GNLY, LYZ, S100A8, NKG7, FTL, GZMB, IGLL5, CCL5, FTH1
  ```

**第三步：PCA+UMAP降维，然后聚类**

```r
pbmc <- RunPCA(pbmc, verbose = FALSE)
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:30, verbose = FALSE)

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:30, verbose = FALSE)
pbmc <- FindClusters(pbmc, verbose = FALSE)
DimPlot(pbmc, label = TRUE) + NoLegend()
```

得到的结果是：

![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2019-10-10-011358.png)

**注意到：这里的`FindNeighbors`使用了更多的主成分（30个）**，而之前常规分析中根据`ElbowPlot(pbmc)`结果仅使用了10个主成分就得了不错的结果。

这是因为：

> * 在常规分析中，使用少量的PC既能关注到关键的生物学差异，又能够不引入更多的技术差异，相当于一种保守性的做法。是的，它会失去一些生物差异信息，但是同时又在常规手段中比较安全。
> * 这里使用的`sctransform`，显然更“自信”一些，它认为：我很厉害，我的归一化、标准化都做得不错，多给我一些PCs吧，我能提取更多的生物差异，并且兼顾不引入技术误差

另外，常规分析中的`FindVariableFeatures`默认得到2000个高变异基因（HVGs），而**这里的`sctransform`因为使用了更多的PCs，算法也更优化，所以默认会得到3000个HVGs**。sctransform认为：新增加的这1000个基因就包含了之前没有检测到的微弱的生物学差异。而且，即使使用全部的全部的基因去做下游分析，得到的结果也是和`sctransform`这3000个基因的结果相似

**综合：单行代码实现分析**

因为SCTransform对参数的要求不是很多，一般默认参数就能应付大多数情况，因此作者也给出了单行从创建对象到最后分群的结果

```r
pbmc <- CreateSeuratObject(pbmc_data) %>% PercentageFeatureSet(pattern = "^MT-", col.name = "percent.mt") %>% 
    SCTransform(vars.to.regress = "percent.mt") %>% RunPCA() %>% FindNeighbors(dims = 1:30) %>% 
    RunUMAP(dims = 1:30) %>% FindClusters()
```

### **关于SCTransform得到的结果**

作为了解即可：它利用了正则化负二项分布（regularized negative binomial regression）计算了技术噪音模型，得到的残差是归一化值，有正有负。正值表示：考虑到细胞群体中基因的平均表达量和细胞测序深度，某个细胞的某个基因所包含的UMIs比预测值要高。

**它的结果有以下几种，不过都包含在pbmc\[\["SCT"]]**

* `pbmc[["SCT"]]@scale.data` ：包含了残差数据，用作PCA的输入。这个数据不是稀疏矩阵，因此会占用大量内存。不过SCTransform函数计算的时候，为了节省内存，默认使用了`return.only.var.genes = TRUE` ，只保留差异基因的结果
* `pbmc[["SCT"]]@counts` ：包含了校正后的UMI count值
* `pbmc[["SCT"]]@data`：包含了上面count值的log-normalized结果，有利于后面可视化
* 目前可以使用`pbmc[["SCT"]]@data`结果进行差异分析，但实际上，官方更推荐直接使用残差值`pbmc[["SCT"]]@scale.data` 【这个功能目前还不支持，会在后面的Seurat版本中更新】

**第四步：使用一些权威的marker对细胞群体注释**

这些marker的选择：

* CD8 T cell populations (naive, memory, effector), based on CD8A, GZMK, CCL5, GZMK expression
* CD4 T cell populations (naive, memory, IFN-activated) based on S100A4, CCR7, IL32, and ISG15
* Additional developmental sub-structure in B cell cluster, based on TCL1A, FCER2
* Additional separation of NK cells into CD56dim vs. bright clusters, based on XCL1 and FCGR3A

```r
VlnPlot(pbmc, features = c("CD8A", "GZMK", "CCL5", "S100A4", "ANXA1", "CCR7", "ISG15", "CD3D"), 
    pt.size = 0.2, ncol = 4)

FeaturePlot(pbmc, features = c("CD8A", "GZMK", "CCL5", "S100A4", "ANXA1", "CCR7"), pt.size = 0.2, 
    ncol = 3)

FeaturePlot(pbmc, features = c("CD3D", "ISG15", "TCL1A", "FCER2", "XCL1", "FCGR3A"), pt.size = 0.2, 
    ncol = 3)
```