单细胞交响乐
  • 前言:我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇:背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇:文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了,你用过几种?
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法|2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA(co-varying neighborhood analysis)
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE:单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus,想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇:分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇:活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇:开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数?
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较:integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
由 GitBook 提供支持
在本页
  • 前言
  • 现在再使用sctransform看看结果
  • 关于SCTransform得到的结果

这有帮助吗?

  1. 5 补充篇:开拓思路
  2. 5.5 多个数据集的整合

5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应

刘小泽写于19.10.10

上一页5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合

最后更新于4年前

这有帮助吗?

上一次介绍了,但是merge只是将原始数据简单混合起来,谁也不知道混合后的结果是不是引入了批次效应

关于去除多组数据中的批次效应,有多种算法,如Seurat包的CCA(canonical correlation analysis)、LIGER的NMF(non-negative matrix factorization)、、Seurat包的sctransform

这次就来看看sctransform是如何使用的

前言

目前教程更新于2020-04-17

它的开发者曾说:

还支持管道单行命令:

现在再使用sctransform看看结果

第一步:加载10X原始数据,创建对象

# 原始数据在:https://s3-us-west-2.amazonaws.com/10x.files/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz
pbmc_data <- Read10X(data.dir = "./filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc_data)

第二步:记录线粒体信息,一会进行校正

pbmc <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-", col.name = "percent.mt")

pbmc <- SCTransform(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt", verbose = FALSE)
  • 别看SCTransform只有一个单独的函数,其实它做了:NormalizeData 、ScaleData、FindVariableFeatures 的事情,并且也支持ScaleData的vars.to.regress

  • 运行的结果存储在:pbmc@assays$SCT) 或者pbmc[["SCT"]]

    > dim(pbmc@assays$RNA)
    [1] 32738  2700
    > dim(pbmc@assays$SCT)
    [1] 12572  2700
    > pbmc@assays$SCT
    Assay data with 12572 features for 2700 cells
    Top 10 variable features:
     S100A9, GNLY, LYZ, S100A8, NKG7, FTL, GZMB, IGLL5, CCL5, FTH1

第三步:PCA+UMAP降维,然后聚类

pbmc <- RunPCA(pbmc, verbose = FALSE)
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:30, verbose = FALSE)

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:30, verbose = FALSE)
pbmc <- FindClusters(pbmc, verbose = FALSE)
DimPlot(pbmc, label = TRUE) + NoLegend()

得到的结果是:

注意到:这里的FindNeighbors使用了更多的主成分(30个),而之前常规分析中根据ElbowPlot(pbmc)结果仅使用了10个主成分就得了不错的结果。

这是因为:

  • 在常规分析中,使用少量的PC既能关注到关键的生物学差异,又能够不引入更多的技术差异,相当于一种保守性的做法。是的,它会失去一些生物差异信息,但是同时又在常规手段中比较安全。

  • 这里使用的sctransform,显然更“自信”一些,它认为:我很厉害,我的归一化、标准化都做得不错,多给我一些PCs吧,我能提取更多的生物差异,并且兼顾不引入技术误差

另外,常规分析中的FindVariableFeatures默认得到2000个高变异基因(HVGs),而这里的sctransform因为使用了更多的PCs,算法也更优化,所以默认会得到3000个HVGs。sctransform认为:新增加的这1000个基因就包含了之前没有检测到的微弱的生物学差异。而且,即使使用全部的全部的基因去做下游分析,得到的结果也是和sctransform这3000个基因的结果相似

综合:单行代码实现分析

因为SCTransform对参数的要求不是很多,一般默认参数就能应付大多数情况,因此作者也给出了单行从创建对象到最后分群的结果

pbmc <- CreateSeuratObject(pbmc_data) %>% PercentageFeatureSet(pattern = "^MT-", col.name = "percent.mt") %>% 
    SCTransform(vars.to.regress = "percent.mt") %>% RunPCA() %>% FindNeighbors(dims = 1:30) %>% 
    RunUMAP(dims = 1:30) %>% FindClusters()

关于SCTransform得到的结果

作为了解即可:它利用了正则化负二项分布(regularized negative binomial regression)计算了技术噪音模型,得到的残差是归一化值,有正有负。正值表示:考虑到细胞群体中基因的平均表达量和细胞测序深度,某个细胞的某个基因所包含的UMIs比预测值要高。

它的结果有以下几种,不过都包含在pbmc[["SCT"]]

  • pbmc[["SCT"]]@scale.data :包含了残差数据,用作PCA的输入。这个数据不是稀疏矩阵,因此会占用大量内存。不过SCTransform函数计算的时候,为了节省内存,默认使用了return.only.var.genes = TRUE ,只保留差异基因的结果

  • pbmc[["SCT"]]@counts :包含了校正后的UMI count值

  • pbmc[["SCT"]]@data:包含了上面count值的log-normalized结果,有利于后面可视化

  • 目前可以使用pbmc[["SCT"]]@data结果进行差异分析,但实际上,官方更推荐直接使用残差值pbmc[["SCT"]]@scale.data 【这个功能目前还不支持,会在后面的Seurat版本中更新】

第四步:使用一些权威的marker对细胞群体注释

这些marker的选择:

  • CD8 T cell populations (naive, memory, effector), based on CD8A, GZMK, CCL5, GZMK expression

  • CD4 T cell populations (naive, memory, IFN-activated) based on S100A4, CCR7, IL32, and ISG15

  • Additional developmental sub-structure in B cell cluster, based on TCL1A, FCER2

  • Additional separation of NK cells into CD56dim vs. bright clusters, based on XCL1 and FCGR3A

VlnPlot(pbmc, features = c("CD8A", "GZMK", "CCL5", "S100A4", "ANXA1", "CCR7", "ISG15", "CD3D"), 
    pt.size = 0.2, ncol = 4)

FeaturePlot(pbmc, features = c("CD8A", "GZMK", "CCL5", "S100A4", "ANXA1", "CCR7"), pt.size = 0.2, 
    ncol = 3)

FeaturePlot(pbmc, features = c("CD3D", "ISG15", "TCL1A", "FCER2", "XCL1", "FCGR3A"), pt.size = 0.2, 
    ncol = 3)

,得到的UMAP结果是:

之前利用常规流程处理
使用Seurat 的merge函数来合并4个样本(各有2个生物学重复)的8组数据
Scran包的mnnCorrect
https://satijalab.org/seurat/v3.1/sctransform_vignette.html