# 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
> 这一篇是免疫相关，美国Fred Hutchinson癌症研究中心于2018年9月发表在NC的[Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA](https://www.nature.com/articles/s41467-018-06300-3)，本文的重点在于单细胞数据的分析部分
由于是第一次接触免疫相关，因此相关的背景知识需要列一下
## 背景知识
* **HLA（human leukocyte antigen）**：人类白细胞抗原，它是一组紧密连锁的基因群，可以控制细胞间相互识别、调节免疫应答。HLA的部分基因可以编码细胞表面抗原受体，成为自身细胞的"独特的信号"，可以作为免疫系统区分自身和异体物质的基础
HLA抗原决定簇在Chr6的短臂上，分为三类：Class I、II、III，是目前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域，[IMGT/HLA](https://app.gitbook.com/s/-MCv4XZpjUYDdSrsYVkw/02/IMGT/HLA) 数据库中就记录了HLA Class I、II的基因型，[截止2019.4已经记录了22,528个等位基因](https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html)
(图片来自文章：Role of MHC-Linked Susceptibility Genes in the Pathogenesis of Human and Murine Lupus)
Class I基因编码的抗原受体几乎分布于整个细胞表面，作用是呈递内源性抗原；
Class II编码的白细胞抗原只有在吞噬细胞(如巨噬细胞、B细胞)的表面存在，作用是呈递外源性抗原；
Class III 编码的产物主要参与[补体系统](https://zh.wikipedia.org/zh/%E8%A1%A5%E4%BD%93%E7%B3%BB%E7%BB%9F) 的调节
Class I、II基因参与免疫调节，因此它们的等位基因是研究热点(I类主要看A、B、C基因；II类主要是DR、DQ、DP基因)
* **Merkel细胞癌**：皮肤Merkel细胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC)是一种罕见的皮肤侵袭性恶性肿瘤，由Merkel cell polyomavirus (MCPyV)病毒引起。常见于浅肤色的老年人，有局部复发和区域淋巴结转移的倾向。其他名称如：皮肤神经内分泌癌或原发性小细胞癌、小梁细胞癌等。[最早于1972年由Toker报道](https://www.uptodate.com/contents/pathogenesis-clinical-features-and-diagnosis-of-merkel-cell-neuroendocrine-carcinoma/abstract-text/5009611/pubmed) ，发病人群中95%为白种人，男性发病率高于女性，且随着年龄增长稳步升高。 疾病相关死亡率约为33%\~46%，局部MCC患者的5年总生存率为55.6%；晚期疾病患者区域性淋巴结患者5年生存率为35.4%，远处转移患者约为13.5%。临床试验最新结果表明，免疫检查点抑制剂可用过释放抵抗免疫原性肿瘤的抗肿瘤免疫力来改善治疗结果 来自：
* **免疫检查点：** 调节T细胞活化和增殖的主要分子。首个免疫检查点抑制剂靶向的是CD152（CTLA-4），ipilimumab是同类中第一个证实临床试验中转移性黑色素瘤患者总生存率改善的药物（2011年获批）。后来如PD-1/PD-L1抗体问世。免疫检查点抑制剂在多种癌症中的成功应用以及MCC的免疫易感性再次为研发更有效的MCC治疗方案带来希望。
* **ICIs(immune checkpoint inhibitors)/ICB(immune checkpoint blockade):** 免疫检查点抑制剂。T淋巴细胞是抗肿瘤免疫应答中的主要效应细胞，通过识别肿瘤特异性抗原(比如致癌病毒、分化抗原，表观遗传调控分子, 以及致癌过程中产生的新抗原等)产生细胞毒性反应。正常状态下, T淋巴细胞通过表达一系列激活性(促进T细胞分化增殖)和抑制性(抑制T细胞分化增殖)受体来调控免疫平衡，既可以调控生理性免疫应答, 又不会过度激活免疫系统而造成机体自我损伤。
但是肿瘤微环境中，随着肿瘤抗原对T细胞的持续刺激, T细胞表面的一系列抑制性受体表达水平升高，同时配体在癌细胞或抗原呈递细胞表面表达水平增高，将抑制T细胞活化增殖并诱导T细胞凋亡，从而导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，造成免疫逃逸。
T细胞表面表达的抑制性受体主要包括CTLA-4、PD-1、Tim-3、LAG-3、KIR、CD47、TIGIT、CEACAM1、A2AR、IDO1、BTLA、VISTA、CD276、VTCN1等，这些**抑制性受体所对应的抑制性信号通路**称为免疫检查点
（来自
* **肿瘤新生抗原负荷（tumor neoantigen burden， TNB）**：癌细胞不断扩增分裂，会产生很多新的突变。新的突变有一部分会形成新生抗原，新生抗原可以激活免疫系统。因此肿瘤新生抗原负荷越高，对这个药物的反应性就有可能越大
* **外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)**：
## 研究背景
癌症免疫治疗在临床上前景巨大，但是目前有许多使用这种技术的患者后来出现复发的状况。
本文团队在研究Merkel细胞时发现，20%的患者对免疫治疗有初步反应，但后来存在复发的情况，预后不理想。为了提高预后，理解后期/获得性免疫治疗耐受性的机理是有必要的。利用细胞免疫治疗临床试验，可以表征T细胞《=》抗原的相互作用，进而了解复杂的肿瘤细胞-免疫细胞之间的关系，并且为避免肿瘤复发应采取何种免疫联合疗法提供帮助。
## 研究方法
> 大体思路就是：癌症患者免疫治疗=》发现抗性复发=》scRNA-Seq=》研究获得性抗性机理
最初采用联合疗法对两名Merkel患者进行治疗，发现肿瘤逐渐缩小，他们出现的显著的肿瘤消退都与活化的CD8+T细胞浸润到消退的肿瘤组织有关。
这两例患者分别为：
* The **primary** patient (2586-4) received hypofractionated radiation for HLA
upregulation to some but not all disease sites
* The second **validation patient** (9245-3) is a 59-year-old man with metastatic MCC that had initially presented as stage IIIB disease, now metastatic at multiple sites
取了患者的血液和肿瘤，做了免疫组化、分选、外显子测序、10X scRNA-Seq、qPCR
### **外显子测序**
两个患者2586-4 (discovery) and 9245-3 (validation)，从外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中分离DNA作为germline对照，然后取出肿瘤免疫治疗前以及获得性抗性的样本。
患者2586-4采用Agilent SureSelect Human All Exon V6 芯片+HiSeq 2500，annovar比对hg19，MuTect检测somatic突变；
患者9245-3采用xGen建库+Hiseq4000(100X)，BWA比对到hg19，GATK call variants
### **单细胞测序\[重头戏]**
**1-- 原始数据**
患者2586-4：利用10X 3' Chromium v2.0平台建库 + Hiseq2500 "rapid run"模式；
[GSE117988](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117988)
```
ID Description
GSM3330559 Tumor Disc Pre
GSM3330560 Tumor Disc AR
GSM3330561 PBMC Pre
GSM3330562 PBMC Disc Early
GSM3330563 PBMC Disc Resp
GSM3330564 PBMC Disc AR
```
患者9245-3：利用10X 5' V(D)J 进行cell washing, barcoding and library prep+ NovaSeq 6000(gene expression) + Hiseq4000 (V(D)J)
[GSE118056](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE118056)
```
ID Description
GSM3317833 PBMC Relapse - L001
GSM3317834 PBMC Relapse - L002
GSM3317835 Tumor Relapse - L001
GSM3317836 Tumor Relapse - L002
```
**2-- Transcriptome alignment, barcode assignment and UMI counting**
患者2586-4(discovery) 利用Cell Ranger v2.0.0， 9245-3 (validation)利用Cell Ranger v2.1.0，进行sample demultiplexing, barcode processing and single-cell gene counting。
首先，利用`mkfastq`流程将原始的BCL文件转为fastq；然后，利用`count`流程整合了STAR将每个fastq与hg38和Merkel cell polyomavirus序列（HM011556.1）比对，比对后的reads根据cell barcode以及UMIs进行过滤
> **Cell barcodes** with **1-Hamming-distance** from a list of known barcodes were considered； **UMIs** with sequencing **quality score >10%** and not homopolymers were retained.
接着利用`aggr`流程将Tumor与PBMC样本整合，生成两个gene-barcode表达矩阵(tumor和PBMC的)，同时进行了测序深度的校正
**3-- Data normalization and correction**
根据这篇文献的方法：Miller, N. J. et al. [Tumor-infiltrating Merkel cell polyomavirus-specific T cells are diverse and associated with improved patient survival](http://cancerimmunolres.aacrjournals.org/content/5/2/137). Cancer Immunol. Res 5, 137–147 (2017).
利用Seurat包中的ScaleData 函数进行校正和标准化：
* Only genes with **at least one UMI count detected in at least one cell** were retained for analysis.
* **Library-size normalization** was performed for each cell.
* UMI counts were **scaled** by the **total number** of UMI
**in each cell** and **multiplied by the median** of the total UMI counts **across cells**
* **log2-transformed** and corrected for unwanted sources of variation
corrected-normalized **gene-barcode** matrix 文件将作为**下游降维、聚类**的输入文件；
normalized **gene-cell barcode** matrix文件将进行**MAST analysis**
**4-- Gene expression analysis: discovery patient tumor**
过滤得到了**7431 tumor cells** (2243 cells before and 5188 cells after T cell therapy)，然后利用corrected-normalized gene-barcode matrix进行PCA、tSNE
首先，利用Seurat挑出了873个表达量变化最大的基因进行PCA
> 根据：log-mean expression values > 0.0125 and dispersion (variance/mean) >0.5
接着，挑出前10个PCs进行tSNE
> **One thousand iterations** of tSNE using a **perplexity value of 30** were performed
然后利用MCC tumor markers(NCAM1, ENO2, CHGA and KRT20 and TILs)细胞分群、聚类，得到T细胞免疫**治疗前的1984个癌细胞和治疗后获得抗性的5131个细胞；**
又利用MAST的R包对前后的细胞进行差异分析，利用的是normalized gene-cell barcode，其中利用了cellular detection rate (CDR) 作为协变量，校正可能影响细胞中检测到基因数的生物和技术偏差。差异基因定义为FDR为5%，fold change>1.3
**5-- Gene expression analysis: discovery patient PBMC**
PBMC涉及到了4个时间点：pre-treatment、early post treatment day+27、responding post treatment day +37、replace/acquired resistance post treatment day +64
过滤后总共得到12,874个细胞，也是利用corrected-normalized gene-barcode matrix进行PCA、tSNE分析。
首先，选择1203个变化最大的基因； 然后选10个PCs进行tSNE(同上)；细胞聚类使用Seurat的FindCluster函数，得到13个不同的细胞群(参数：neighborhood size of 40 and resolution of 0.6)，根据分群的结果，移除了三个在red blood cell and megakaryocyte markers中富集的cluster，总共剩下11,021个细胞； 之后利用FindMarkers函数根据marker的富集情况，给细胞群加标签，结果有9个不同的cluster：CD4+ T cells, CD8+ T cells, CD8+ effector T cells, B cells, NK cells, CD14+ monocytes, CD16+ monocytes, myeloid cells and dendritic cells； CD8+与CD8+ effector T细胞的在第三个时间点（responding阶段）差异基因分析也是利用MAST。代码见Supplementary Data 3.
**6--Gene expression analysis: validation patient**
利用corrected-normalized gene-barcode matrix去做PCA、tSNE，方法同上=》19个不同的clusters。代码见Supplementary Data 4.
### 单细胞部分研究结果
重点关注单细胞部分，免疫原理部分这里不做深入研究。
> **先是PBMC细胞**
**首先是discovery(2586-4)患者PBMC在4个时间点鉴定的活化CD8+ T细胞分群：**
* 治疗前（pre-treatment）
* 治疗后早期（early post-treatment (day +27）；
* 治疗反应 （treatment response (day + 376)；
* 晚期/获得抗性（late/acquired resistance (day +614)
**对11021个细胞进行tSNE分析的分群结果显示：**
**代表性的marker基因如下：**
（从b-i都是为了辅助细胞分群鉴定，蓝色表示基因表达，且颜色越深表达量越高）
**另外根据4个先后时间点做出的细胞分群如下**
其中响应免疫疗法的激活的CD8+淋巴细胞簇是箭头指的红色部分，将不同时间点的CD8+对比发现Day +376(response时间点)的CD8+细胞簇最多
继续将Day +376(response时间点)的red activated cluster (n =170) 与 blue effector/EM cluster (n = 429) 进行差异分析，得到45个差异基因，热图展示一部分：
> **接下来是肿瘤组织**，时间点和PBMC不同，它只有两个治疗前的原位癌pre-treatment、复发癌 late relapse/acquired resistance
首先可以看到的是，这个组织中肿瘤细胞占比较大，并且治疗前后分的还是很开的，意味着治疗前（蓝色）与复发后（橘色）差别还是很大的，为了看这个差异是由哪些基因导致的，又做了差异分析+热图，得到255个差异基因
其中箭头标出的位置是HLA-B，它在复发瘤中表达量降低，那么下降的趋势如何呢？
发现与HLA-A相比，MCC在获得性抗性中显著下调HLA-B
之后在另一个患者那里进行验证（11267个细胞）：也发现类似的情况，只不过是HLA-A表达量降低
## 讨论
晚期/获得性免疫抗性是免疫治疗治愈的障碍，本文对两名接受T细胞免疫治疗与ICI的患者，他们都有持续的免疫治疗反应，之后是抗性产生。观察到CD8+ T细胞浸润到萎缩的MCC肿瘤中，支持T细胞介导的消退，当肿瘤复发的时候，存在着**明显的选择性转录下调HLA**。
肿瘤能够通过沉默能够被T细胞识别的蛋白的编码基因进而实现肿瘤的免疫躲避。HLA的三组基因通常全部同时关闭或打开，**HLA三组基因只要其中一个被关闭，那么肿瘤细胞就能逃避T细胞**
单个或所有的I类HLAs基因缺失导致的免疫逃避被描述为对细胞免疫治疗产生细胞免疫抗性机制和抗pd -1检查点抑制剂机制。第I类基因座的转录抑制也许也是其他免疫治疗产生耐药性的原因（包括免疫检查点治疗），这项发现将为设计新型免疫治疗手段带来积极影响。