2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
刘小泽写于2021.10.18
最后更新于
刘小泽写于2021.10.18
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题目：Microfluidics applications for high-throughput single cell sequencing
日期：2021-10-11
期刊：Journal of Nanobiotechnology
链接：https://jnanobiotechnology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12951-021-01045-6
细胞群体中单个细胞的异质性在疾病的发展和进展中起着重要作用，但目前大多数传统的基因分析方法掩盖了单个细胞的差异。单细胞测序可以展示单个细胞的内在异质性，并揭示复杂和稀有的细胞群。近十年来，针对单细胞研究出现了不同的微流控技术，成为领域前沿。这篇综述介绍了单细胞测序的过程，并回顾了用于单细胞测序的微流体原理，讨论了常见的高通量单细胞测序技术及其优缺点。
单个细胞是生物体的基本结构和功能单位。在相同的外部刺激或生理条件下，源自同一类型细胞的细胞可能会表现出细胞间差异。许多传统研究，例如细胞分化和基因表达，都着眼于细胞群，这是多个细胞的“整体”表现。异质性可以在看起来相同的细胞的形态、组成、功能和遗传行为中出现，而对大量异质细胞群的分析只能提供多个细胞的平均数据，从而丢失很多低丰度信息。为了解决这个困境，需要在单个细胞水平上分析细胞群。
2009年，汤富酬课题组首次报道了哺乳动物单细胞的mRNA-seq全转录组分析方法；2011 年，Navin 等人首次实现了人类单个细胞的基因组测序，用来研究乳腺癌肿瘤细胞群的结构和进化。近10年（2010-2020年）单细胞测序发展日新月异。
1990 年代初期，Manz 和Widmer 提出了微型化全化学分析系统（miniaturized total chemical analysis system, μTAS）的概念，使生物样品的分析更加高效和灵敏。微流控技术作为 μTAS 的关键组成部分，已迅速发展成为生命科学和分析化学领域的前沿研究方法。微流体，也称为“芯片实验室”，是一种以简单有效的方式分析单个细胞的新型工具。
与传统技术相比，微流体技术在分析样品方面具有多项优势：
首先，微流控芯片的结构和功能设计灵活，可以满足单细胞分析的需求
其次，典型的微流体通道具有几十到几百微米的尺寸，可以处理从皮升到纳升的溶液体积，从而减少样品损失和高灵敏度，并使高通量单细胞分析成为可能
此外，多功能单元和微流控芯片的集成可以实现自动化，防止人为操作产生的测量误差
主要过程包括单细胞分离、单细胞裂解、核酸扩增、高通量测序、数据处理和数据分析
与传统测序方法不同，单细胞的分离是这项技术的关键，三个词形容： fast, effective, and gentle
目前，分离单细胞样品的方法包括有限稀释、显微操作、激光捕获显微切割（Laser capture microdissection, LCM）、荧光激活细胞分选（fluorescence activated cell sorters, FACS）和微流控技术。
有限稀释主要使用手动移液器或移液机器人来分离单个细胞，其每等份细胞数的概率服从泊松分布。这种方法已经过时了，因为它不能排除一些小细胞群
手动细胞采摘的显微操作通过结合显微镜和微量移液器，并应用吸力来捕获单个细胞，但是从显微操作中获得的细胞可能会受到机械损伤
LCM 是一种先进的工具，可在切片和染色处理后从大部分实体组织样本中快速准确地获取单个细胞或细胞区室。该方法成功地保持了细胞形态和结构，并保留了空间位置信息
FACS 系统通过在各种类型的流式细胞仪中用荧光标签标记细胞的特定表面分子，细胞流快速通过激光束以提供光激发，然后下游的光检测器用于捕获具有特定信号的细胞， 具有高通量，在细胞分选方面非常有效
微流控是一种在微观尺度上精确控制流体的新技术，具有体积小、样品消耗少、反应速度快、分选精度高、操作灵活等特点。微流体装置具有多通道结构，通道宽度从 10 到 100 μm 不等，使其能够适应每个单个细胞的大小和体积。大多数微流体设备使用以下微流体原理来隔离单个细胞：流体动力学细胞陷阱、气动膜阀和基于油滴的隔离。目前最流行的微流体隔离方法是应用微滴将单个细胞封装在惰性载体油中，从而形成一个封闭空间，降低样品污染的风险
常见的细胞裂解方法，如物理、化学和酶法
物理方法：目前主要存在三种主要的物理细胞裂解形式：机械、热和电。机械裂解主要通过机械力分离细胞膜；热裂解取决于细胞膜蛋白的热诱导变性，需要额外的温度循环；电裂解通过电场诱导的分子重新定向破坏细胞膜
化学细胞裂解应用裂解缓冲液并诱导高效裂解以破坏细胞
酶促细胞裂解通常使用酶的组合来实现细胞的完全解离，这也是减少DNA断裂的最温和的方法。可以使用蛋白酶，如胃蛋白酶和胰蛋白酶
选择最合适的裂解方法时需要考虑多种因素，包括细胞类型、下游分析、基因组 DNA (gDNA) 纯化的难度
单个细胞中DNA或RNA等核酸的含量远低于测序所需的样本量（哺乳动物细胞中大约有 10 pg 的总 RNA），因此扩增过程对于后续分析至关重要。
目前，常见的扩增方法有两种：全基因组扩增（WGA）和全转录组扩增（WTA）。
目前可用的 WGA 方法包括简并寡核苷酸引发的聚合酶链反应 (DOP-PCR)、多重置换扩增 (MDA) 和多重退火和循环扩增循环 (MALBAC)
WTA 需要一个逆转录过程来产生 cDNA 样本。大约 10-20% 的 mRNA 在这个阶段被逆转录。目前可用的 WTA 方法包括传统 PCR、改良 PCR、T7 体外转录 (T7-in vitro transcription, IVT) 和 Phi29 DNA 聚合酶介导的 RNA 扩增
在单细胞转录组中，cDNA 扩增从来都不是完全线性的，会导致细胞中cDNA的浓度与实际不成比例。因此可以使用独特的分子标识符 (unique molecular identifiers, UMI) 来标记primary RNA 以减少扩增偏差。
另外，测序前应评估RNA的质量，最常用的方法是Sanger测序，但研究表明droplet digital PCR (ddPCR) 具有更高的优势，它独立于标准曲线和循环阈值（CT）值，大大提高了检测微量核酸和稀有序列的灵敏度、特异性和精确度。
目前主要有基因组、转录组和表观基因组的测序，帮助反映单细胞发育轨迹的基本构成。
单细胞基因组测序，即scDNA-seq，揭示细胞基因组的突变和结构变化，突出体细胞克隆结构，追踪疾病的进化和传播
单细胞转录组测序，即 scRNA-seq，可以以单细胞分辨率测量转录组中的基因表达，识别细胞簇中的生物学相关差异
单细胞表观基因组测序侧重于不改变 DNA 序列的表型的可遗传变化，涉及 DNA 甲基化、染色质可及性、组蛋白修饰和 DNA 折叠，反映基因组结构变异如何影响细胞表型。其中单细胞亚硫酸氢盐测序 (scBS-seq) 被用作 DNA 甲基化研究的金标准。
生成 scRNA-seq 文库所需的常见步骤包括逆转录成第一链 cDNA、合成第二链 cDNA 和 cDNA 扩增 。在 scRNA-seq中，单个细胞中的所有转录本都通过逆转录转化为 cDNA，其中一些方法支持整个转录组测序，而另一些方法只允许对转录组的 5' 和 3' 末端进行测序。例如，Smart-seq2 支持 cDNA 测序的全读长覆盖，Fluidigm C1就可以自动完成Smart-seq，可以执行 96 次单细胞捕获、裂解、逆转录和预扩增；Drop-seq、inDrop 和 10X Chromium 系统仅提供 cDNA 的 5' 或 3' 端的序列信息，因此不适用于可变剪接模式的分析。
微流控芯片大致可分为三种技术原理：traps-based microfluidics, valves-based microfluidics, and droplet-based microfluidics
如图A，一个凹槽就是一个细胞”陷阱“，然后很多个陷阱会放在微流控芯片上，能够高效捕获单个细胞，培养细胞污染风险低，高达 97% 的陷阱可以捕获单个细胞。陷阱的直径取决于所研究细胞的大小。通过将陷阱直径调整为样本中的平均细胞大小，可以最大限度地减少多细胞情况。
阀门用于隔离通道网络的特定区域，允许生成反应室并进行独立的反应。阀门可以根据需要打开和关闭，从而允许复杂的操作。基于阀门的微流体系统允许在芯片上进行自动操作，有助于以高精度和控制准确模拟细胞微环境的动态。
微型阀门可分为主动机械式、主动非机械式、被动机械式和被动非机械式四大类。一般来说，主动机械微阀因其最佳性能而最常用于微流体系统，而简单的被动阀更适合实际应用。基于阀门的微流体技术由 Quake 实验室于 2000 年首次开发，实现了大规模微流体集成和自动化的突破。他们也利用 (Microfluidic large scale integration, mLSI) 技术在全自动微流控芯片上分离 mRNA、合成 cDNA 和纯化 DNA。
微滴技术可实现小样本量的高通量筛选，可以应用于单细胞水平的多种生物学检测，包括单细胞培养、基因组学和转录组学分析、数字PCR、RNA-seq ，抗体检测，药物递送和筛选，毒性筛选和诊断。
微流控芯片上，液滴会随着一种液相分离另一种不混溶的液体而产生。基于液滴的微流体技术可以精确地操纵微通道中的流体，并通过注入载体油来封装单个细胞，从而可以快速且一致地生成大小可控且均匀的液滴。基于液滴的微流体封装单个细胞并提供理想的微反应器，每个液滴在功能上相当于微孔板中的一个孔，但反应体积小一百万倍。每秒可以产生数千个单独的隔室，表面活性剂用于降低表面张力并防止液滴融合。此外，由于微反应器的数量不受芯片物理尺寸的限制，液滴本质上是可扩展的。
液滴是通过使用两种不混溶的流体，载体流体（ carrier fluid）和分散流体（dispersed fluid）产生的。
可以通过使用三种不同几何形状的微流体装置实现液滴的生成，例如 T-junctions, flow focusing and co-flow
大量文献表明，基于液滴的微流体技术已发展成为一种极好的单细胞培养方法。含有单个细胞的液滴可以在微流体装置内原位培养，甚至可以转移用于芯片外培养。例如Wong等人开发了一种基于液滴的微流体技术，用于在癌细胞系或原发性肿瘤的细胞中进行药物筛选。通过这种方式，单个细胞分散在液滴中，并在药物处理 24 小时内成像以评估细胞活力 (Wong AHH, Li HR, Jia YW, Mak PI, Martins RPdS, Liu Y, et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 2017;7(1):9109.)
不过，液滴中细胞的封装是随机的，并且在很大程度上依赖于泊松统计，因此基于液滴的微流体技术可能会产生空液滴和包含多个细胞的液滴。研发人员可以通过优化通道设计来最大限度地增加包含单个细胞的液滴数量，以提高单个细胞在生成液滴中的包裹率。
基于微孔板的 scRNA-seq 技术
这个技术依赖于将单个细胞捕获或分选到管或多孔板中进行单细胞分析。
Smart-seq 旨在提高转录本读取覆盖率并增强对单核苷酸多态性的评估。相比之下，Smart-seq2 可以实现更多读取甚至全长读取覆盖和更高的灵敏度，这被称为 Smart-seq的升级版，并且可以提供有关基因突变、基因选择性剪接和等位基因特异性表达的信息，广泛用于单细胞全长 mRNA 分析。Fluidigm C1 是一个广泛使用的商业平台，它依赖于 Smart-seq ，可在单个芯片上为多达 800 个细胞提供自动化的单细胞裂解、RNA 提取和 cDNA 合成。
CEL-seq 是第一个在体外使用 cDNA 转录线性扩增的方法，通过混合样本并且使用barcode区分的方法克服了 RNA 起始量小的限制。不过只能用于 3' 端测序
此外，还有单细胞标记逆转录测序（STRT-seq）、大规模平行RNA单细胞测序（MARS-seq）、单细胞RNA条形码和测序（SCRB-seq）
基于微流控的 scRNA-seq 方法
目前最流行的高通量平台是基于液滴的微流体，即微液滴，优点包括低试剂和样品体积，以及短细胞加载期。inDrop和 Drop-seq 于 2015 年首次应用，使用特定的油来生成包含裂解缓冲液、barcode和细胞的液滴。细胞裂解后，条形码寡核苷酸与释放的 mRNA 的 poly(A) 杂交，确保文库制备和测序。
inDrop通过水凝胶微球引入寡核苷酸，在液滴中进行细胞裂解和逆转录。水凝胶珠溶解在液滴中，释放出寡核苷酸与 mRNA 杂交，逆转录反应在液滴内进行。然而，inDrop 的主要缺点是细胞捕获效率极低，每个细胞只能检测 20-50 个转录本。Drop-seq 库包含 1600 万个条形码，而 inDrop 技术仅产生约 150,000 个条形码，这意味着 inDrop 每次运行处理的细胞更少。适用于分析非常小的组织样本，因为它比 Drop-seq 捕获更高百分比的细胞。
Drop-seq 倾向于使用条形码珠（ barcoded beads），而 inDrop 则使用条形码水凝胶微球（barcoded hydrogel microspheres）。 条形码珠包括了扩增序列、barcode、UMI和捕获单细胞 mRNA 分子的寡核苷酸 (dT) 序列。珠子连同附着的寡核苷酸和退火的 mRNA 都从液滴中释放出来并组合到一个管中，然后进行逆转录
10X genomics使用Gel bead in EMulsion (GEM) 中封装数千个单细胞，获得的数据比 Drop-seq 质量更高（在每个细胞中检测到更多的基因并降低了技术噪音）
