单细胞交响乐
  • 前言:我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇:背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇:文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了,你用过几种?
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法|2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA(co-varying neighborhood analysis)
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE:单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus,想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇:分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇:活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇:开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数?
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较:integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
由 GitBook 提供支持
在本页

这有帮助吗?

  1. 5 补充篇:开拓思路
  2. 5.2 CellRanger篇

5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项

刘小泽写于19.5.4-5.5

上一页5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载下一页5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探

最后更新于4年前

这有帮助吗?

上次拿到了sra原始数据,接下来就要使用10X官方的软件cell ranger进行操作了,但使用前需要注意几个地方

将SRA转为fastq

我们使用fastq-dump这款软件,它是sra-tool中的一个工具,使用conda安装即可

conda install -c bioconda sra-tools

关于这个软件,参数设置一般比较简单(虽然帮助文档写的不是那么好理解)

wkd=/home/project/single-cell/MCC
cd $wkd/raw/P2586-4
cat SRR_Acc_List-2586-4.txt |while read i
do
time fastq-dump --gzip --split-3 -A $i ${i}.sra && echo "** ${i}.sra to fastq done **"
done

其中主要使用了三个参数:

  • --gzip将生成的结果fastq文件进行压缩

  • --split-3其实有点复杂:首先它是分割的意思,-3实际上指的是分成3个文件,它诞生的时间比较早,是在1000 Genome的Phase1阶段产生的。

    如果结果发现只有一个文件,说明数据不是双端(第三个文件太大会覆盖前两个);

    如果结果有两个文件,说明是双端文件并且数据质量比较高(没有低质量的reads或者长度小于20bp的reads);

    如果结果有三个文件,说明是双端文件,但是有的数据质量不高,存在trim的结果,第三个文件的名字一般是:<srr_id>.fastq, 而且文件也不大,基本可以忽略

  • -A指定输出的文件名

如果使用上面的参数--split-3,结果只有一个fq文件

利用cell ranger软件分析,一般需要两个输入文件,其中一个是测序reads,另一个是UMI+Barcode文件,那么只生成一个文件是不够的,因此可以换个参数

但是前两个呢?哪一个是UMI+Barcode?

如何解释生成的这三个fastq文件

单细胞转录组数据和普通的bulk转录组还是不太一样,bulk结果一般就是R1、R2,很容易区分;10X单细胞数据比较特殊,它的测序文库中包括index、barcode、UMI和测序reads。

先大概了解一下10X文库组成:

其中Read2:98那里的星号表示这个长度不是固定的,可以调整,比如文章中患者P2586-4的Read2长度就是98,而患者9245-3的Read2长度是91

然后看看测序时每个run cycle做了什么事:

利用illumina边合成变测序(sequencing by synthesis ,SBS),每一个cycle都是一个碱基,因此用cycle数可以表示测序长度

首先,1-26个cycle就是测序得到了26个碱基,先是16个Barcode碱基,然后是10个UMI碱基;

然后,27-34这8个cycle得到了8个碱基,就是i7的sample index;

最后35-132个cycle得到了98个碱基,就是转录本reads

看下Read1、i7 index、Read2的碱基分布:

可以看到转录本read前端有20多bp质量是存在波动的,因为5’端的前几个碱基为随机引物序列,存在一定的偏好性

另外,index和barcode有什么区别,为什么用两个fq文件进行区分?

  • 然后回过头,又看了看GEO的数据记录,发现的确记录了index信息,

    但是作者没有上传最原始的BCL文件,因此无法体验mkfastq的功能,但是官网有测试数据。这里了解大体的拆分流程就好

  • 10X Barcode(Cell barcode) 是10X特有的,用来区分GEMs,也就是对细胞做了一个标记。一般在拆分混养测序数据(demultiplexing)这个过程后进行操作,当然这也很符合原文的操作

  • 在实验建库的过程中,barcoding过程(也就是GEM生成的过程)是早于indexing过程(它是PCR的最后阶段),但是生信分析过程把这两个顺序颠倒过来了,我们需要先根据样本index,利用mkfastq 将reads进行demultiplex,分到各自的测序文库中去,然后对每个文库再处理barcodes信息

UMI的作用呢?

它是为处理PCR 扩增偏差而生

首先,不管是bulk RNA还是scRNA,都需要进行PCR扩增,但是不可避免有一些转录本会被扩增太多次,超过了真实表达量。当起始文库大小很小时(比如单细胞数据),就需要更多次的PCR过程,这个次数越多,引入的误差就越大

UMI就是Unique Molecular Identifier,由4-10个随机核苷酸组成,在mRNA反转录后,进入到文库中,每一个mRNA随机连上一个UMI,根据PCR结果可以计数不同的UMI,最终统计mRNA的数量。

UMI有几个要求:

  • 不能有N碱基

  • 不能包含碱基质量低于10的碱基

综上所述:raw fastq中包含以下信息

  • Library Barcode (Sample Index) - Used to pool multiple samples on one sequencing lane

  • Cell Barcode (10x Barcode) – Used to identify the cell the read came from

  • Unique Molecular Index (UMI) – Used to identify reads that arise during PCR replication

  • Sequencing Reads – Used to identify the gene a read came from

那么这三个文件的名称需要修改吗?

那么怎么改?

肯定要批量处理,就利用下载SRA的SRR ID好了

# 比如,将原来的SRR7692286_1.fastq.gz改成SRR7692286_S1_L001_I1_001.fastq.gz
# 依次类推,将原来_2的改成R1,将_3改成R2
cat  SRR_Acc_List-9245-3.txt | while read i ;do (mv ${i}_1*.gz ${i}_S1_L001_I1_001.fastq.gz;mv ${i}_2*.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;mv ${i}_3*.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done

使用另外一个参数--split-files来替代--split-3 ,就可以生成三个文件,其中第一个文件的所有序列都是8bp,第二个文件都是26bp,第三个文件都是91bp,初步判断,第三个文件是测序reads

这里可以对比下这两个参数输出的数据

文章使用的是10X Genomics 3' Chromium v2.0 平台,那么就看一下它的帮助手册( )

找到10X官方给出的一个解答:

i7 sample index(library barcode)是加到Illumina测序接头上的,保证多个测序文库可以在同一个flow-cell上或者同一个lane上进行混合测序(multiplexed)。当然可以自己指定index,但更多情况下会使用10X公司提供的index序列(bundled index sets),针对不同项目使用的index也是不同的。不过共性就是:96孔板的每个孔中都加入了4种不同的index oligos混合(详见:)。 它的作用就是在CellRanger的mkfastq 功能中体现出来的,它自动识别样本index名称(例如:SA-GA-A1),将具有相同4种oligo的fq文件组合在一起,表示同一个样本。它保证了一个测序lane上可以容纳多个样本

不能是 ,如AAAAAAAAAA

我认为是需要修改的,因为命名太模糊,不容易指定文件进行下游分析。 然后看到官网给出的解答: ,也的确说需要修改

https://www.biostars.org/p/186741/
https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/1CnKSfa7taoQwIEe0WaA4m/8635b2c9ee86c022e731b6fb2e13fed2/CG000080_10x_Technical_Note_Base_Composition_SC3_v2_RevB.pdf
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/115002777072-How-do-I-demultiplex-by-sample-index-and-barcode-
均聚物
https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/2.0/using/fastq-input#wrongname
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/218168503-What-oligos-are-in-my-sample-index-
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