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# 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
> 上次拿到了sra原始数据，接下来就要使用10X官方的软件cell ranger进行操作了，但使用前需要注意几个地方
#### 将SRA转为fastq
我们使用`fastq-dump`这款软件，它是sra-tool中的一个工具，使用conda安装即可
```
conda install -c bioconda sra-tools
```
关于这个软件，参数设置一般比较简单(虽然帮助文档写的不是那么好理解)
```
wkd=/home/project/single-cell/MCC
cd $wkd/raw/P2586-4
cat SRR_Acc_List-2586-4.txt |while read i
do
time fastq-dump --gzip --split-3 -A $i ${i}.sra && echo "** ${i}.sra to fastq done **"
done
```
其中主要使用了三个参数：
* `--gzip`将生成的结果fastq文件进行压缩
* `--split-3`其实有点复杂：首先它是分割的意思，`-3`实际上指的是分成3个文件，它诞生的时间比较早，是在1000 Genome的Phase1阶段产生的。
如果结果发现只有一个文件，说明数据不是双端(第三个文件太大会覆盖前两个)；
如果结果有两个文件，说明是双端文件并且数据质量比较高(没有低质量的reads或者长度小于20bp的reads)；
如果结果有三个文件，说明是双端文件，但是有的数据质量不高，存在trim的结果，第三个文件的名字一般是：`.fastq`， 而且文件也不大，基本可以忽略
* -A指定输出的文件名
**如果使用上面的参数`--split-3`，结果只有一个fq文件**
利用cell ranger软件分析，一般需要两个输入文件，其中一个是测序reads，另一个是UMI+Barcode文件，那么只生成一个文件是不够的，因此可以换个参数
**使用另外一个参数`--split-files`来替代`--split-3` ，就可以生成三个文件**，其中第一个文件的所有序列都是8bp，第二个文件都是26bp，第三个文件都是91bp，初步判断，第三个文件是测序reads
> 这里可以对比下这两个参数输出的数据 
但是前两个呢？哪一个是UMI+Barcode？
#### 如何解释生成的这三个fastq文件
单细胞转录组数据和普通的bulk转录组还是不太一样，bulk结果一般就是R1、R2，很容易区分；10X单细胞数据比较特殊，它的测序文库中包括index、barcode、UMI和测序reads。
文章使用的是10X Genomics 3' Chromium v2.0 平台，那么就看一下它的帮助手册（ ）
**先大概了解一下10X文库组成：**
其中Read2：98那里的星号表示这个长度不是固定的，可以调整，比如文章中患者P2586-4的Read2长度就是98，而患者9245-3的Read2长度是91
**然后看看测序时每个run cycle做了什么事：**
> 利用illumina边合成变测序（sequencing by synthesis ,SBS），每一个cycle都是一个碱基，因此用cycle数可以表示测序长度
首先，1-26个cycle就是测序得到了26个碱基，先是16个Barcode碱基，然后是10个UMI碱基；
然后，27-34这8个cycle得到了8个碱基，就是i7的sample index；
最后35-132个cycle得到了98个碱基，就是转录本reads
**看下Read1、i7 index、Read2的碱基分布：**
可以看到转录本read前端有20多bp质量是存在波动的，因为5’端的前几个碱基为随机引物序列，存在一定的偏好性
**另外，index和barcode有什么区别，为什么用两个fq文件进行区分？**
找到10X官方给出的一个解答：
* **i7 sample index（library barcode）**是加到Illumina测序接头上的，保证多个测序文库可以在同一个flow-cell上或者同一个lane上进行混合测序(multiplexed)。当然可以自己指定index，但更多情况下会使用10X公司提供的index序列(bundled index sets)，针对不同项目使用的index也是不同的。不过共性就是：96孔板的每个孔中都加入了4种不同的index oligos混合(详见：)。 它的作用就是在CellRanger的`mkfastq` 功能中体现出来的，它自动识别样本index名称（例如：SA-GA-A1），将具有相同4种oligo的fq文件组合在一起，表示同一个样本。它保证了一个测序lane上可以容纳多个样本
> 然后回过头，又看了看GEO的数据记录，发现的确记录了index信息，
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> 但是作者没有上传最原始的BCL文件，因此无法体验mkfastq的功能，但是官网有测试数据。这里了解大体的拆分流程就好
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* **10X Barcode（Cell barcode）** 是10X特有的，用来区分GEMs，也就是对细胞做了一个标记。一般在拆分混养测序数据（demultiplexing）这个过程后进行操作，当然这也很符合原文的操作
* 在实验建库的过程中，barcoding过程(也就是GEM生成的过程)是早于indexing过程(它是PCR的最后阶段)，但是生信分析过程把这两个顺序颠倒过来了，我们需要先根据样本index，利用`mkfastq` 将reads进行demultiplex，分到各自的测序文库中去，然后对每个文库再处理barcodes信息
**UMI的作用呢？**
> 它是为处理PCR 扩增偏差而生
首先，不管是bulk RNA还是scRNA，都需要进行PCR扩增，但是不可避免有一些转录本会被扩增太多次，超过了真实表达量。当起始文库大小很小时（比如单细胞数据），就需要更多次的PCR过程，这个次数越多，引入的误差就越大
UMI就是Unique Molecular Identifier，由4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，根据PCR结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量。
UMI有几个要求：
* 不能是[均聚物](https://zh.wikipedia.org/zh-hans/%E5%9D%87%E8%81%9A%E7%89%A9) ，如AAAAAAAAAA
* 不能有N碱基
* 不能包含碱基质量低于10的碱基
**综上所述：raw fastq中包含以下信息**
> * **Library Barcode (Sample Index)** - Used to pool multiple samples on one sequencing lane
> * **Cell Barcode (10x Barcode)** – Used to identify the cell the read came from
> * **Unique Molecular Index (UMI)** – Used to identify reads that arise during PCR replication
> * **Sequencing Reads** – Used to identify the gene a read came from
**那么这三个文件的名称需要修改吗？**
> 我认为是需要修改的，因为命名太模糊，不容易指定文件进行下游分析。 然后看到官网给出的解答： ，也的确说需要修改
**那么怎么改？**
肯定要批量处理，就利用下载SRA的SRR ID好了
```
# 比如，将原来的SRR7692286_1.fastq.gz改成SRR7692286_S1_L001_I1_001.fastq.gz
# 依次类推，将原来_2的改成R1，将_3改成R2
cat SRR_Acc_List-9245-3.txt | while read i ;do (mv ${i}_1*.gz ${i}_S1_L001_I1_001.fastq.gz;mv ${i}_2*.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;mv ${i}_3*.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done
```
