单细胞交响乐
搜索文档…
⌃K
Links

2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控

刘小泽写于2021.11.04

前言

题目:Dynamic transcriptional reprogramming leads to immunotherapeutic vulnerabilities in myeloma
日期:2021-10-21
期刊:Nature Cell Biology

一句话概括

7张主图+10张附图,而且每一张都至少有5-6张小图,使用上百张图片来说明:利用单细胞转录组+表观遗传分析骨髓瘤的细胞状态,从而研究异质性,帮助理解其中的基因调控网络,并帮助识别潜在的治疗靶点

需要补充一点背景知识

https://www.zs-hospital.sh.cn/zsyy/n33/n35/n48/n399/n403/u1ai3894.html
骨髓位于人体较大的骨骼的腔中,约占人体体重的 5%,含有间充质干细胞和造血干细胞
人体所有的血细胞都是由造血干细胞分化、增殖而成的,包括:红细胞、白细胞和血小板
  • 红细胞:可以将氧气从肺部输送至身体的各个部位
  • 血小板:具有止血功能
  • 白细胞:人体免疫系统的基石,包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞
浆细胞是淋巴细胞中 B 淋巴细胞分化的产物,它能分泌抗体,消灭入侵人体的病毒、细菌等。如果 B 淋巴细胞在分化成浆细胞的过程中 DNA 受到破坏,这个异变的浆细胞回到骨髓后,又再次受到环境的刺激时,就会发生癌变,也就成为了骨髓瘤细胞
相比于正常的浆细胞,骨髓瘤细胞会以更快的速度分裂,并且分泌一种异变蛋白 - Paraprotein,这种异变蛋白没有抗体的免疫功能,医学上叫单克隆伽马球蛋白,或者单克隆丙种球蛋白

转录机制part1——表达

不过文章写了8个病人,但主图只显示了7个,而且也没看到说明原因
选取8个relapsed/refractory MM病人骨髓或血液中的骨髓瘤细胞以及CD45+ 免疫细胞,以及2个健康供体,使用SmartSeq2得到单细胞全长转录组,共 6,955 cells,利用PAGODA2进行分群,其中 clusters 20, 1, 5, 7, 14, 12, 3 and 13对应了CD4+ and CD8+ T cells, NK cells, B cells, monocytes and neutrophils(中性粒细胞);clusters 2, 4, 6, 8, 10, 11, 15, 16, 17 and 19对应了plasma cell
multiple myeloma (MM),多发性骨髓瘤
然后分析CNV区分恶性和非恶性细胞,不管是malignant score(图f)还是CNV扩展、缺失(图e),MM样本都要比ND正常样本高。另外还使用随机森林模型,寻找区分这两种类型细胞的marker基因,像是CCND1、FRZB13都是之前报道过的,而且这个CCND1在3/8的MM病人中都高表达。另外,还看了其他的signature,比如NFKB signature主要在MM1病人表达,proliferation signature PR 主要在MM8病人表达
Could not load image

既然表达有差异,那么接下来继续深入探索

首先推测:细胞周期对表达异质性会有影响
G、S、M期(https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle)
  • G1期(间期的DNA合成前期)
  • S期(间期的DNA合成期),启动DNA合成
  • G2期(间期的DNA合成后期)
  • M期(有丝分裂期),存在检测点和抑制点
发现分群之间没有太大的细胞周期差异(除了cluster10,可能因为这个cluster覆盖的病人样本比较多吧)
然后,使用非负矩阵分解(negative matrix factorization,NMF)
得到6个表达模式,除了细胞周期,还有很多细胞信号通路,包括KRAS–MAPK signalling, IL-2–STAT5 signalling, the interferon (IFN) response and IL-6–STAT3 signalling

探索骨髓瘤细胞转录水平变化的方向

BLUEPRINT不同的细胞类型:https://www.blueprint-epigenome.eu/index.cfm?p=7BCEDA45-EC73-3496-2C823D929DD423DB
使用BLUEPRINT数据集的不同细胞谱系的signature,发现骨髓瘤细胞的转录状态主要集中于浆细胞(PC)和一些未成熟的前体细胞(Megakaryocyte-erythroid precursor ,MEP)【图ab】,确实存在不同的变化阶段
接着利用RNA velocity analysis看了分化轨迹
得到一个由低分化向高分化的轨迹,正常样本的浆细胞聚集在尾部(标志着分化的结束),而正在分化的细胞聚在头部。再结合上图的e图,使用CytoTRACE看到骨髓瘤细胞具有比正常浆细胞更高的CytoTRACE score,标志着更好的分化潜能
接下来,看分化轨迹两端的差异
拿到CytoTRACE 分数高的细胞(也代表了未成熟状态),找到他们的top基因,做了通路(上图g),发现与代谢途径、Myc激活有关,还有一个plasmablast-like signature。
另外发现头尾具有截然相反的通路激活情况,比如上面的图h中MAPK通路,在头部高尾部低;而PI3K是尾部更高

转录机制part2——调控

首先看基因调控网络GRN

【图a】利用SCENIC看转录因子活性,利用BLUEPRINT数据,找到正常造血中的主导调控因子存在于浆细胞(PC module);
【图b】再看自己的数据:正常的供体中,这个PC module确实占主导;而骨髓瘤样本中,PC module除了在浆细胞,还在haemopoietic stem cell 、macrophage等类型中发现
接下来就是寻找骨髓瘤细胞特异的调控网络(图c),但其中好多调控元件在正常的数据中都没有或者很弱,比如ELF3、TEAD4(图d)
  • ELF3 is a member of the epithelium-specific ETS TFs expressed predominantly in epithelial tissues
  • TEAD4 acts as a downstream regulator of the Hippo pathway and binds to the M-CAT motif found primarily in muscle-specific genes
另外还发现了恶性和正常的浆细胞共有的一些调控元件,比如XBP1, IRF4 and PRDM1 ,说明骨髓瘤细胞还是保留了一些原有细胞谱系的印记
接着,引入一个指标(rewiring score),意思是看看一个调控元件改变后,与之相关的基因变化程度(在网络中可以理解为node对targets的影响;或者简单理解为rewiring score代表了影响力)。发现ELF3和TEAD4是两个得分最高的,其次是XBP1,说明它们对基因影响是比较大的。

调控差异的产生,对染色质可接近性有影响吗?

对5个病人+3个正常做了scATAC-seq,得到 1,483个细胞,注释分群得到:
  • clusters 1–6:plasma cell
  • clusters 7, 8 and 9:monocytes, B cells and NK cells
同时对比图b、c发现了cluster分群存在病人特异性,说明不同病人存在不同的染色质差异
Could not load image
image-20211104165510661
接着做了peak calling,其中MM特有的是29,761个peaks,而正常特有的只有不到8000个;另外用DESeq2找了MM和正常的差异peaks,差异也是一致的(图c-d)
ChromHMM对peaks进行注释,发现很多MM的peaks落在了异染色质,并且在intronic and intergenic区域更多,说明MM可能募集到更多的增强子enhancer;同时发现MM的可开放区域距离TSS很远,这个和之前报道的骨髓瘤H3K27 乙酰化程度升高一致
image-20211104163825168
为了阐释scATAC数据集的差异,做了拟时序分析。发现在MM中比较重要的一些基因,比如CCND1和ELF3,在轨迹的”头部“表现更高的开放程度【主图e】,又分析了motif accessibility,发现NF-κB family members REL, RELA and NFKB1 得分比较高,并且集中于”尾部“的正常样本。用chromVAR 进行差异分析,得到276个TFs。
图i-j基于ELF3 and TEAD4 预测了顺式作用因子, 为MM中存在增强子激活再次提供证据