5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
刘小泽写于19.5.6
首先对上次改好名称的fastq数据进行质控
# 以P2586-4为例
mkdir -p $wkd/qc
cd $wkd/qc
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R1*.gz'>P2586-4-id-1.txt
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R2*.gz'>P2586-4-id-2.txt
cat P2586-4-id-1.txt P2586-4-id-2.txt >P2586-4-id-all.txt
cat P2586-4-id-all.txt| xargs fastqc -t 20 -o ./
然后利用Filezilla下载其中SRR7722937的R1、R2的html，打开看下
首先是R1的，这个就是16bp Barcode+10bp UMI，可以看到Phred值是比较稳定的
然后看下真实的测序数据：它的Phred值开始质量较差，中间较好，测序结束位置质量有下降，这是和测序仪的工作原理有关的
测序仪在刚开始进行合成反应的时候也会由于反应还不够稳定，会带来质量值的波动；碱基的合成利用的的是聚合酶化学反应，使得碱基可以从5’端向3’端合成并延伸。但合成的过程中随着链的增长，DNA聚合酶的效率会不断下降，特异性也开始变差，越到后面碱基合成的错误率就会越高）
总体上还是在Q30以上的，数据质量不错，并且没有接头序列
如果要对Fastqc结果进行详细的了解，可以去官网的帮助信息，非常的简明扼要：<https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/3%20Analysis%20Modules/
Cell Ranger的介绍
什么是Cell Ranger？
官网的说明最原汁原味： Cell Ranger is a set of analysis pipelines that process Chromium single cell 3’ RNA-seq output to align reads, generate gene-cell matrices and perform clustering and gene expression analysis.
到目前为止，它有1.0，1.1，1.2，1.3，2.0，2.1，2.2，3.0这8个版本，其中1.2版本之后的可以支持Chromium Single Cell 3' v1 and v2 试剂，最新的V3试剂需要用到3.0版本
要分析的文章中使用了两个不同的版本（2.0和2.1）去分析两个患者的数据：
那么这个软件能干什么事？
它主要包括四个主要基因表达分析流程：
cellranger mkfastq ： 它借鉴了Illumina的
bcl2fastq，可以将一个或多个lane中的混样测序样本按照index标签生成样本对应的fastq文件cellranger count ：利用
mkfastq生成的fq文件，进行比对(基于STAR)、过滤、UMI计数。利用细胞的barcode生成gene-barcode矩阵，然后进行样本分群、基因表达分析cellranger aggr ：接受
cellranger count的输出数据，将同一组的不同测序样本的表达矩阵整合在一起，比如tumor组原来有4个样本，PBMC组有两个样本，现在可以使用aggr生成最后的tumor和PBMC两个矩阵，并且进行标准化去掉测序深度的影响cellranger reanalyze ：接受
cellranger count或cellranger aggr生成的gene-barcode矩阵，使用不同的参数进行降维、聚类
它的结果主要是包含有细胞信息的BAM, MEX, CSV, HDF5 and HTML文件
相关的术语
Sample：（样本）从单一来源(比如血液、组织等)提取的细胞悬液
Library：（文库）单个样本制备的10X barcode 测序文库，对应10X Chromium Controller一个run（即运行一次）的单个芯片通道
Sequencing Run / Flowcell: 测序仪主要依靠flowcell（例如Hiseq4000就有2个flowcell），每运行一次就是run一次，数据会在flowcell上产出，然后这些数据又会根据flowcell上的不同lane以及lane上不同样本的index进行区分
以上术语的错综复杂：
单独一个样本可以制备成多个文库，这样可以一次run就得到更多的细胞数量，而不用在单次run的单个文库中使用全部的样品，造成"过载"现象("过犹不及")
单独一个样本可以跨多个flowcell测序，如果它们是在一次测序过程中产出，就可以将产出的reads合并
上面说一个文库可以用多个flowcell，那么一个flowcell也可以包含多个文库，使用不同的lane上或者样本的index进行区分
同一个10x 芯片的两个channels可以说是两个文库，但是两个不同芯片的同一个channel不能说是两个文库
大体流程
主要根据sample、library、flowcell的数量来定义分析的复杂程度(由浅入深)
一个sample、一个library、一个flowcell
这是最基本的模式：只有一个生物样本，只需要制备一个文库，在一个flowcell上测序就好，通过
mkfastq得到fastq文件后直接运行count就好(具体见： Single-Library Analysis)一个sample，多个library
如果一个样本有多个文库(比如做了技术重复)，那么每一个文库的数据应该单独跑
cellranger count流程，然后可以利用aggr整合起来， Multi-Library Aggregation ； 当然先将一个样本的多个文库组合在一起再分析也是可以的，就需要利用到 MRO syntax (这里先做了解)多个samples
必须每个样本的每个文库单独跑
cellranger count，比如说：实验中有4个样本，每个样本由两个文库(或者两个技术重复)，那么就需要跑count流程8次，最后利用aggr汇总在一起
Cell Ranger的安装与配置
系统要求
Linux 至少8核CPU(推荐16核)
64GB RAM(推荐128GB)，最低配的64G允许
cellranger aggr合并最多250k个细胞1T硬盘
64-bit CentOS/RedHat 6.0 or Ubuntu 12.04
软件依赖
大多软件是和Cell Ranger打包在一起的，但是cellranger mkfastq 依然需要Illumina bcl2fastq (要求版本2.17以上；如果使用Novaseq，最好用版本2.20或者更高)
使用资源限制
Cell Ranger默认在本地运行(或者使用--jobmode=local指定)，它会占用90%的空余内存以及所有空余的CPU。如果要进行资源限制，可以使用—localmem或者--localcores
使用
localcores之前，应该先检查ulimit -u，看看服务器最大支持多少用户同时在线，因为cellranger使用一个核就会产生64个用户队列，不能超过这个限定值。例如检查ulimit -u为4096，那么最多设置64个核心，也就是64 * 64 = 4096，才不会因为这个报错
下载软件
为了复现文章，我们需要用到Cell Ranger 2.0与2.1，其中2.0版本是2017年9月发布的，2.1版本是2018年2月发布的
软件下载完，需要解压缩一段时间，因为它打包了太多的软件和资源
然后添加环境变量(注意：如果之前安装过其他版本，比如我之前装过3.0，但是当前你只想用这个2.0版本，那么就需要在~/.bashrc中将新安装的2.0版本路径放在3.0的下方，因为linux是根据$PATH自上而下调用软件的，将新安装的路径放在.bashrc下方，那么在$PATH中显示的就是新路径在上方，它们的顺序是相反的)
然后安装好以后，cellranger还提供了一个小工具(我认为是个有意思的地方)，让你全面了解你的linux性能，不用自己找代码。另外这些代码我们也可以借鉴，以后再用
为了确保软件所有的自带流程都成功安装，可以进行一个软件自检
参考序列下载(1.2.0版本，2016年12月发布)
文章比对到了hg38(基于ensembl数据库)，不能直接使用网站下载的基因组与注释文件，需要过滤一下
如果直接下载的话一共11GB，当然这里面包含了基因组、注释源文件，以及cell ranger自己利用mkgtf构建的注释和mkref构建的基因组
如果要自己尝试构建，可以使用
最后更新于
这有帮助吗？