# 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑 ## 1 前言 使用了一个存在异质性的数据集，是研究小鼠大脑的 ([Zeisel et al. 2015](https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25700174/)) 其中大约包含3000个细胞，包括少突胶质细胞，小胶质细胞和神经元等，使用的细胞分离平台是Fluidigm C1微流控系统，属于比较早期的系统【[单细胞测序的知识](https://www.jianshu.com/p/9fc521bf82ba)】 ![发展历史](https://1260378310-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-MCv4XZpjUYDdSrsYVkw%2F-MCzH7Oo07eVDtwMWDAF%2F-MCzH_2G579QltZNn9qp%2Fimage.png?alt=media\&token=c51730af-19e6-479c-9ddd-4a93e4ed976c) ### 文库制备时加入了UMI > **UMI简单解释：** UMI就是为了去除PCR扩增偏差的。一般一个基因对应多个UMI时，出现多个reads含有同一个UMI时，这里只计数一次。 > > **UMI英文解释：** Each transcript molecule can only produce one UMI count but can yield many reads after fragmentation > > **UMI详细解释：** 不管是bulk RNA还是scRNA，都需要进行PCR扩增，但是不可避免有一些转录本会被扩增太多次，超过了真实表达量。当起始文库很小时（比如单细胞数据），就需要更多次的PCR过程，这个次数越多，引入的误差就越大。UMI就是Unique Molecular Identifier，由4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，根据PCR结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量。 > > **UMI图片解释：** > > ![image-20200719150326484](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-070326.png) ![image-20200719150624540](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-070625.png) > > **UMI有几个要求：** > > * 不能是[均聚物](https://zh.wikipedia.org/zh-hans/%E5%9D%87%E8%81%9A%E7%89%A9) ，如AAAAAAAAAA > * 不能有N碱基 > * 不能包含碱基质量低于10的碱基 ## 2 数据准备 ```r # 自己下载 library(scRNAseq) sce.zeisel <- ZeiselBrainData() # 或者使用之前分享的RData load('sce.zeisel.RData') sce.zeisel # class: SingleCellExperiment # dim: 20006 3005 # metadata(0): # assays(1): counts # rownames(20006): Tspan12 Tshz1 ... mt-Rnr1 # mt-Nd4l # rowData names(1): featureType # colnames(3005): 1772071015_C02 1772071017_G12 # ... 1772066098_A12 1772058148_F03 # colData names(10): tissue group # ... # level1class level2class # reducedDimNames(0): # altExpNames(2): ERCC repeat ``` 看到这么几个信息：2万多基因，3005个样本；只有原始count矩阵；使用了symbol ID；加入了ERCC ```r # 有57个ERCC > dim(altExp(sce.zeisel,'ERCC')) [1] 57 3005 # 而且已经标注了线粒体基因 > table(rowData(sce.zeisel)) endogenous mito 19972 34 ``` ### **一个重要操作：aggregateAcrossFeatures** > 英文解释是：Sum together expression values (by default, counts) for each feature set in each cell. 但是只看说明还是不好理解，举个例子： **可以看到下面会有很多基因具有多个loc** 比如`OTTMUSG00000016609_loc4`、`OTTMUSG00000016609_loc3` 其实可以算作一个基因 ```r head(rownames(sce.zeisel)[grep("_loc[0-9]+$",rownames(sce.zeisel))]) # [1] "Syne1_loc2" "Hist1h2ap_loc1" # [3] "Inadl_loc1" "OTTMUSG00000016609_loc4" # [5] "OTTMUSG00000016609_loc3" "Gm5643_loc2" # 这样的有300多个 > length(grep("_loc[0-9]+$",rownames(sce.zeisel))) [1] 330 ``` **如果拿一个基因来看** Syne1有Syne1\_loc1和Syne1\_loc2 ```r > length(grep("Syne1",rownames(sce.zeisel))) [1] 2 counts(sce.zeisel)[grep("Syne1",rownames(sce.zeisel)),][1:2,1:3] # 1772071015_C02 1772071017_G12 1772071017_A05 # Syne1_loc2 11 2 4 # Syne1_loc1 0 0 4 ``` **如果使用这个函数，会有怎样效果** ```r test <- aggregateAcrossFeatures(sce.zeisel, id=sub("_loc[0-9]+$", "", rownames(sce.zeisel))) # 只剩一个了，也就是合二为一 > length(grep("Syne1",rownames(test))) [1] 1 # 看表达量，也是合二为一 > counts(test)[grep("Syne1",rownames(test)),][1:3] 1772071015_C02 1772071017_G12 1772071017_A05 11 2 8 ``` 因此，明白了，**这个函数就是处理相同行：把几个相同的行的值加在一起变为一行** 也就明白了，下面👇为什么要进行`sub`操作，其实就是为了把loc去掉，暴露出相同的基因名，才能执行`aggregateAcrossFeatures`函数 ```r sce.zeisel <- aggregateAcrossFeatures(sce.zeisel, id=sub("_loc[0-9]+$", "", rownames(sce.zeisel))) > dim(sce.zeisel) [1] 19839 3005 ``` ### **再添加Ensembl ID** ```r library(org.Mm.eg.db) rowData(sce.zeisel)$Ensembl <- mapIds(org.Mm.eg.db, keys=rownames(sce.zeisel), keytype="SYMBOL", column="ENSEMBL") ``` ## 3 质控 ### 备份数据 还是备份一下，把unfiltered数据主要用在质控的探索上 ```r unfiltered <- sce.zeisel ``` 这个公共数据的作者在发表文章时将数据的低质量细胞去掉了，但并不妨碍我们做个质控，也可以看看它去除的怎样 ```r stats <- perCellQCMetrics(sce.zeisel, subsets=list( Mt=rowData(sce.zeisel)$featureType=="mito")) qc <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets=c("altexps_ERCC_percent", "subsets_Mt_percent")) sce.zeisel <- sce.zeisel[,!qc$discard] > sum(qc$discard) [1] 189 > dim(sce.zeisel) [1] 19839 2816 ``` ### **根据原来的数据，加上质控标准作图** ```r colData(unfiltered) <- cbind(colData(unfiltered), stats) unfiltered$discard <- qc$discard # 做个图 gridExtra::grid.arrange( plotColData(unfiltered, y="sum", colour_by="discard") + scale_y_log10() + ggtitle("Total count"), plotColData(unfiltered, y="detected", colour_by="discard") + scale_y_log10() + ggtitle("Detected features"), plotColData(unfiltered, y="altexps_ERCC_percent", colour_by="discard") + ggtitle("ERCC percent"), plotColData(unfiltered, y="subsets_Mt_percent", colour_by="discard") + ggtitle("Mito percent"), ncol=2 ) ``` ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-085835.png) ### **再看下文库大小和ERCC分别和线粒体含量的关系** ```r gridExtra::grid.arrange( plotColData(unfiltered, x="sum", y="subsets_Mt_percent", colour_by="discard") + scale_x_log10(), plotColData(unfiltered, x="altexps_ERCC_percent", y="subsets_Mt_percent", colour_by="discard"), ncol=2 ) ``` ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-085923.png) ### **然后检查一下被过滤的原因** ```r ## low_lib_size low_n_features high_altexps_ERCC_percent ## 0 3 65 ## high_subsets_Mt_percent discard ## 128 189 ``` ## 4 归一化 这里细胞数量较多，因此需要预先分群+去卷积计算size factor ```r library(scran) set.seed(1000) clusters <- quickCluster(sce.zeisel) sce.zeisel <- computeSumFactors(sce.zeisel, cluster=clusters) sce.zeisel <- logNormCounts(sce.zeisel) summary(sizeFactors(sce.zeisel)) ## Min. 1st Qu. Median Mean 3rd Qu. Max. ## 0.119 0.486 0.831 1.000 1.321 4.509 ``` **看看两种归一化方法的差异** ```r # 常规：最简单的只考虑文库大小 summary(librarySizeFactors(sce.zeisel)) # Min. 1st Qu. Median Mean 3rd Qu. Max. # 0.1757 0.5680 0.8680 1.0000 1.2783 4.0839 plot(librarySizeFactors(sce.zeisel), sizeFactors(sce.zeisel), pch=16, xlab="Library size factors", ylab="Deconvolution factors", log="xy") ``` ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-090527.png) ## 5 找表达量高变化基因 理论上，应该对每个细胞都标记批次信息，添加`block`信息。但是这里由于技术不同，每个板子上只有20-40个细胞，并且细胞群体具有高度异质性，不能假设每个板上的细胞类型的分布是相同的，因此这里不使用`block`将批次信息“锁住”是合适的 既然有ERCC，就可以用第三种方法【在之前 [3.3 挑选高变化基因](https://jieandze1314.osca.top/03/03-3) 的2.3 考虑技术噪音】： ```r dec.zeisel <- modelGeneVarWithSpikes(sce.zeisel, "ERCC") top.hvgs <- getTopHVGs(dec.zeisel, prop=0.1) > length(top.hvgs) [1] 1816 ``` 同样使用了spike-in，对比一下，看到这里不管总体方差还是技术因素方差都要比之前smart-seq2要小。 > smart-seq2是按read计数，这里由于添加了UMI，是按molecule计数，也就是说，**UMI的加入，确实减少了PCR扩增的偏差影响** 另外图中看到，这里STRT-seq的spike-in方差一直要比内源基因的方差小，也就是说内源基因的变化幅度一直保持高位，体现了数据中包含多种细胞类型而导致的异质性，异质性导致了基因表达极度不均衡 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-091219.png) ## 6 降维 ```r library(BiocSingular) set.seed(101011001) sce.zeisel <- denoisePCA(sce.zeisel, technical=dec.zeisel, subset.row=top.hvgs) sce.zeisel <- runTSNE(sce.zeisel, dimred="PCA") ``` 看一下得到的PC数 ```r ncol(reducedDim(sce.zeisel, "PCA")) ## [1] 50 ``` ## 7 聚类 ```r snn.gr <- buildSNNGraph(sce.zeisel, use.dimred="PCA") colLabels(sce.zeisel) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership) ``` 看一下结果 ```r table(colLabels(sce.zeisel)) ## ## 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ## 283 451 114 143 599 167 191 128 350 70 199 58 39 24 ``` 画图 ```r plotTSNE(sce.zeisel, colour_by="label") ``` ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-092215.png) ## 8 找marker基因并解释结果 > 主要还是关注上调基因，可以帮我们快速判断出异质性群体中各个细胞类型的差异 比如还是针对cluster1看看 ```r markers <- findMarkers(sce.zeisel, direction="up") marker.set <- markers[["1"]] > ncol(marker.set) [1] 17 > colnames(marker.set) [1] "Top" "p.value" "FDR" "summary.logFC" "logFC.2" "logFC.3" "logFC.4" [8] "logFC.5" "logFC.6" "logFC.7" "logFC.8" "logFC.9" "logFC.10" "logFC.11" [15] "logFC.12" "logFC.13" "logFC.14" head(marker.set[,1:8], 10) ``` ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-092744.png) ### **方法一：画热图** **使用cluster1的Top10基因（但不一定只是10个）** ```r top.markers <- rownames(marker.set)[marker.set$Top <= 10] > length(top.markers) [1] 58 plotHeatmap(sce.zeisel, features=top.markers, order_columns_by="label") ``` 接下来就是根据背景知识了，比如看到Gad1、Slc6a1表达量都很高，可能表明cluster1属于中间神经元 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-093013.png) ### **方法二：基于logFC** 比如可以挑出cluster1的计算结果`marker.set`中前50个基因（这里就是50个，而不是Top50），然后根据cluster1与其他clusters的logFC，对每个基因表达量做热图 ```r library(pheatmap) logFCs <- getMarkerEffects(marker.set[1:50,]) pheatmap(logFCs, breaks=seq(-5, 5, length.out=101)) ``` ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-094211.png) 那么**这个函数到底做了什么呢？**看图就知道： > 也就是把每个基因在其他clusters的logFC结果挑出来，汇集成了一个新矩阵，我们自己手动也是可以做到的 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-07-19-094036.png)