单细胞交响乐
  • 前言:我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇:背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇:文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了,你用过几种?
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法|2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA(co-varying neighborhood analysis)
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE:单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus,想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇:分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇:活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇:开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数?
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较:integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
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在本页
  • 1 前言
  • 文库制备时加入了UMI
  • 2 数据准备
  • 一个重要操作:aggregateAcrossFeatures
  • 再添加Ensembl ID
  • 3 质控
  • 备份数据
  • 根据原来的数据,加上质控标准作图
  • 再看下文库大小和ERCC分别和线粒体含量的关系
  • 然后检查一下被过滤的原因
  • 4 归一化
  • 5 找表达量高变化基因
  • 6 降维
  • 7 聚类
  • 8 找marker基因并解释结果
  • 方法一:画热图
  • 方法二:基于logFC

这有帮助吗?

  1. 4 实战篇:活学活用

4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑

刘小泽写于2020.7.19

上一页4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓下一页4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC

最后更新于4年前

这有帮助吗?

1 前言

使用了一个存在异质性的数据集,是研究小鼠大脑的 ()

其中大约包含3000个细胞,包括少突胶质细胞,小胶质细胞和神经元等,使用的细胞分离平台是Fluidigm C1微流控系统,属于比较早期的系统【】

文库制备时加入了UMI

UMI简单解释: UMI就是为了去除PCR扩增偏差的。一般一个基因对应多个UMI时,出现多个reads含有同一个UMI时,这里只计数一次。

UMI英文解释: Each transcript molecule can only produce one UMI count but can yield many reads after fragmentation

UMI详细解释: 不管是bulk RNA还是scRNA,都需要进行PCR扩增,但是不可避免有一些转录本会被扩增太多次,超过了真实表达量。当起始文库很小时(比如单细胞数据),就需要更多次的PCR过程,这个次数越多,引入的误差就越大。UMI就是Unique Molecular Identifier,由4-10个随机核苷酸组成,在mRNA反转录后,进入到文库中,每一个mRNA随机连上一个UMI,根据PCR结果可以计数不同的UMI,最终统计mRNA的数量。

UMI图片解释:

UMI有几个要求:

  • 不能有N碱基

  • 不能包含碱基质量低于10的碱基

2 数据准备

# 自己下载
library(scRNAseq)
sce.zeisel <- ZeiselBrainData()
# 或者使用之前分享的RData
load('sce.zeisel.RData')

sce.zeisel
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 20006 3005 
# metadata(0):
#   assays(1): counts
# rownames(20006): Tspan12 Tshz1 ... mt-Rnr1
# mt-Nd4l
# rowData names(1): featureType
# colnames(3005): 1772071015_C02 1772071017_G12
# ... 1772066098_A12 1772058148_F03
# colData names(10): tissue group # ...
# level1class level2class
# reducedDimNames(0):
#   altExpNames(2): ERCC repeat

看到这么几个信息:2万多基因,3005个样本;只有原始count矩阵;使用了symbol ID;加入了ERCC

# 有57个ERCC
> dim(altExp(sce.zeisel,'ERCC'))
[1]   57 3005

# 而且已经标注了线粒体基因
> table(rowData(sce.zeisel))

endogenous       mito 
     19972         34

一个重要操作:aggregateAcrossFeatures

英文解释是:Sum together expression values (by default, counts) for each feature set in each cell. 但是只看说明还是不好理解,举个例子:

可以看到下面会有很多基因具有多个loc

比如OTTMUSG00000016609_loc4、OTTMUSG00000016609_loc3 其实可以算作一个基因

head(rownames(sce.zeisel)[grep("_loc[0-9]+$",rownames(sce.zeisel))])
# [1] "Syne1_loc2"              "Hist1h2ap_loc1"         
# [3] "Inadl_loc1"              "OTTMUSG00000016609_loc4"
# [5] "OTTMUSG00000016609_loc3" "Gm5643_loc2" 

# 这样的有300多个
> length(grep("_loc[0-9]+$",rownames(sce.zeisel)))
[1] 330

如果拿一个基因来看

Syne1有Syne1_loc1和Syne1_loc2

> length(grep("Syne1",rownames(sce.zeisel)))
[1] 2

counts(sce.zeisel)[grep("Syne1",rownames(sce.zeisel)),][1:2,1:3]
# 1772071015_C02 1772071017_G12 1772071017_A05
# Syne1_loc2             11              2              4
# Syne1_loc1              0              0              4

如果使用这个函数,会有怎样效果

test <- aggregateAcrossFeatures(sce.zeisel, 
                                      id=sub("_loc[0-9]+$", "", rownames(sce.zeisel)))
# 只剩一个了,也就是合二为一
> length(grep("Syne1",rownames(test)))
[1] 1

# 看表达量,也是合二为一
> counts(test)[grep("Syne1",rownames(test)),][1:3]
1772071015_C02 1772071017_G12 1772071017_A05 
            11              2              8

因此,明白了,这个函数就是处理相同行:把几个相同的行的值加在一起变为一行

也就明白了,下面👇为什么要进行sub操作,其实就是为了把loc去掉,暴露出相同的基因名,才能执行aggregateAcrossFeatures函数

sce.zeisel <- aggregateAcrossFeatures(sce.zeisel, 
                                      id=sub("_loc[0-9]+$", "", rownames(sce.zeisel)))

> dim(sce.zeisel)
[1] 19839  3005

再添加Ensembl ID

library(org.Mm.eg.db)
rowData(sce.zeisel)$Ensembl <- mapIds(org.Mm.eg.db, 
    keys=rownames(sce.zeisel), keytype="SYMBOL", column="ENSEMBL")

3 质控

备份数据

还是备份一下,把unfiltered数据主要用在质控的探索上

unfiltered <- sce.zeisel

这个公共数据的作者在发表文章时将数据的低质量细胞去掉了,但并不妨碍我们做个质控,也可以看看它去除的怎样

stats <- perCellQCMetrics(sce.zeisel, subsets=list(
    Mt=rowData(sce.zeisel)$featureType=="mito"))
qc <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets=c("altexps_ERCC_percent", 
    "subsets_Mt_percent"))
sce.zeisel <- sce.zeisel[,!qc$discard]

> sum(qc$discard)
[1] 189

> dim(sce.zeisel)
[1] 19839  2816

根据原来的数据,加上质控标准作图

colData(unfiltered) <- cbind(colData(unfiltered), stats)
unfiltered$discard <- qc$discard
# 做个图
gridExtra::grid.arrange(
    plotColData(unfiltered, y="sum", colour_by="discard") +
        scale_y_log10() + ggtitle("Total count"),
    plotColData(unfiltered, y="detected", colour_by="discard") +
        scale_y_log10() + ggtitle("Detected features"),
    plotColData(unfiltered, y="altexps_ERCC_percent",
        colour_by="discard") + ggtitle("ERCC percent"),
    plotColData(unfiltered, y="subsets_Mt_percent",
        colour_by="discard") + ggtitle("Mito percent"),
    ncol=2
)

再看下文库大小和ERCC分别和线粒体含量的关系

gridExtra::grid.arrange(
    plotColData(unfiltered, x="sum", y="subsets_Mt_percent",
        colour_by="discard") + scale_x_log10(),
    plotColData(unfiltered, x="altexps_ERCC_percent", y="subsets_Mt_percent",
        colour_by="discard"),
    ncol=2
)

然后检查一下被过滤的原因

##              low_lib_size            low_n_features high_altexps_ERCC_percent 
##                         0                         3                        65 
##   high_subsets_Mt_percent                   discard 
##                       128                       189

4 归一化

这里细胞数量较多,因此需要预先分群+去卷积计算size factor

library(scran)
set.seed(1000)
clusters <- quickCluster(sce.zeisel)
sce.zeisel <- computeSumFactors(sce.zeisel, cluster=clusters) 
sce.zeisel <- logNormCounts(sce.zeisel)
summary(sizeFactors(sce.zeisel))
##    Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
##   0.119   0.486   0.831   1.000   1.321   4.509

看看两种归一化方法的差异

# 常规:最简单的只考虑文库大小
summary(librarySizeFactors(sce.zeisel))
# Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
# 0.1757  0.5680  0.8680  1.0000  1.2783  4.0839 

plot(librarySizeFactors(sce.zeisel), sizeFactors(sce.zeisel), pch=16,
    xlab="Library size factors", ylab="Deconvolution factors", log="xy")

5 找表达量高变化基因

理论上,应该对每个细胞都标记批次信息,添加block信息。但是这里由于技术不同,每个板子上只有20-40个细胞,并且细胞群体具有高度异质性,不能假设每个板上的细胞类型的分布是相同的,因此这里不使用block将批次信息“锁住”是合适的

dec.zeisel <- modelGeneVarWithSpikes(sce.zeisel, "ERCC")
top.hvgs <- getTopHVGs(dec.zeisel, prop=0.1)
> length(top.hvgs)
[1] 1816

同样使用了spike-in,对比一下,看到这里不管总体方差还是技术因素方差都要比之前smart-seq2要小。

smart-seq2是按read计数,这里由于添加了UMI,是按molecule计数,也就是说,UMI的加入,确实减少了PCR扩增的偏差影响

另外图中看到,这里STRT-seq的spike-in方差一直要比内源基因的方差小,也就是说内源基因的变化幅度一直保持高位,体现了数据中包含多种细胞类型而导致的异质性,异质性导致了基因表达极度不均衡

6 降维

library(BiocSingular)
set.seed(101011001)
sce.zeisel <- denoisePCA(sce.zeisel, technical=dec.zeisel, subset.row=top.hvgs)
sce.zeisel <- runTSNE(sce.zeisel, dimred="PCA")

看一下得到的PC数

ncol(reducedDim(sce.zeisel, "PCA"))
## [1] 50

7 聚类

snn.gr <- buildSNNGraph(sce.zeisel, use.dimred="PCA")
colLabels(sce.zeisel) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership)

看一下结果

table(colLabels(sce.zeisel))
## 
##   1   2   3   4   5   6   7   8   9  10  11  12  13  14 
## 283 451 114 143 599 167 191 128 350  70 199  58  39  24

画图

plotTSNE(sce.zeisel, colour_by="label")

8 找marker基因并解释结果

主要还是关注上调基因,可以帮我们快速判断出异质性群体中各个细胞类型的差异

比如还是针对cluster1看看

markers <- findMarkers(sce.zeisel, direction="up")
marker.set <- markers[["1"]]

> ncol(marker.set)
[1] 17

> colnames(marker.set)
 [1] "Top"           "p.value"       "FDR"           "summary.logFC" "logFC.2"       "logFC.3"       "logFC.4"      
 [8] "logFC.5"       "logFC.6"       "logFC.7"       "logFC.8"       "logFC.9"       "logFC.10"      "logFC.11"     
[15] "logFC.12"      "logFC.13"      "logFC.14"  


head(marker.set[,1:8], 10)

方法一:画热图

使用cluster1的Top10基因(但不一定只是10个)

top.markers <- rownames(marker.set)[marker.set$Top <= 10]
> length(top.markers)
[1] 58

plotHeatmap(sce.zeisel, features=top.markers, order_columns_by="label")

接下来就是根据背景知识了,比如看到Gad1、Slc6a1表达量都很高,可能表明cluster1属于中间神经元

方法二:基于logFC

比如可以挑出cluster1的计算结果marker.set中前50个基因(这里就是50个,而不是Top50),然后根据cluster1与其他clusters的logFC,对每个基因表达量做热图

library(pheatmap)
logFCs <- getMarkerEffects(marker.set[1:50,])
pheatmap(logFCs, breaks=seq(-5, 5, length.out=101))

那么这个函数到底做了什么呢?看图就知道:

也就是把每个基因在其他clusters的logFC结果挑出来,汇集成了一个新矩阵,我们自己手动也是可以做到的

不能是 ,如AAAAAAAAAA

既然有ERCC,就可以用第三种方法【在之前 的2.3 考虑技术噪音】:

均聚物
3.3 挑选高变化基因
Zeisel et al. 2015
单细胞测序的知识
发展历史
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