单细胞交响乐
  • 前言：我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇：背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇：文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了，你用过几种？
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法｜2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA（co-varying neighborhood analysis）
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE：单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus，想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇：分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇：活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇：开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数？
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较：integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
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在本页
  • 1 前言
  • 数据准备
  • ID转换
  • 2 质控
  • 3 归一化
  • 4 找表达量高变化基因
  • 5 降维聚类
  • 降维就采取最基础的方式：
  • 聚类
  • 作图
  • 6 找marker基因

这有帮助吗？

  1. 4 实战篇：活学活用

4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞

刘小泽写于2020.7.21

上一页4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞下一页4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞

最后更新于4年前

这有帮助吗？

1 前言

数据来自的小鼠造血干细胞 haematopoietic stem cell (HSC) ，使用的技术是CEL-seq

数据准备

library(scRNAseq)
sce.grun.hsc <- GrunHSCData(ensembl=TRUE)
sce.grun.hsc
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 21817 1915 
# metadata(0):
#   assays(1): counts
# rownames(21817): ENSMUSG00000109644
# ENSMUSG00000007777 ... ENSMUSG00000055670
# ENSMUSG00000039068
# rowData names(3): symbol chr originalName
# colnames(1915): JC4_349_HSC_FE_S13_
# JC4_350_HSC_FE_S13_ ...
# JC48P6_1203_HSC_FE_S8_
# JC48P6_1204_HSC_FE_S8_
# colData names(2): sample protocol
# reducedDimNames(0):
#   altExpNames(0):

table(sce.grun.hsc$sample)
# 
# JC20   JC21   JC26   JC27   JC28   JC30   JC32 
# 87     96     85     91     80     96     93 
# JC35   JC36   JC37   JC39    JC4   JC40   JC41 
# 96     80     87     93     84     96     94 
# JC43   JC44   JC45   JC46 JC48P4 JC48P6 JC48P7 
# 92     94     90     96     95     96     94

ID转换

library(AnnotationHub)
ens.mm.v97 <- AnnotationHub()[["AH73905"]]
anno <- select(ens.mm.v97, keys=rownames(sce.grun.hsc), 
               keytype="GENEID", columns=c("SYMBOL", "SEQNAME"))

# 这里全部对应
> sum(is.na(anno$SYMBOL))
[1] 0
> sum(is.na(anno$SEQNAME))
[1] 0

# 接下来只需要匹配顺序即可
rowData(sce.grun.hsc) <- anno[match(rownames(sce.grun.hsc), anno$GENEID),]

sce.grun.hsc
## class: SingleCellExperiment 
## dim: 21817 1915 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(21817): ENSMUSG00000109644 ENSMUSG00000007777 ...
##   ENSMUSG00000055670 ENSMUSG00000039068
## rowData names(3): GENEID SYMBOL SEQNAME
## colnames(1915): JC4_349_HSC_FE_S13_ JC4_350_HSC_FE_S13_ ...
##   JC48P6_1203_HSC_FE_S8_ JC48P6_1204_HSC_FE_S8_
## colData names(2): sample protocol
## reducedDimNames(0):
## altExpNames(0):

2 质控

依然是备份一下，把unfiltered数据主要用在质控的探索上

unfiltered <- sce.grun.hsc

发现这个数据既没有MT也没有ERCC

grep('MT',rowData(sce.grun.hsc)$SEQNAME)
# integer(0)

能用的数据只有其中的protocol了，它表示细胞提取方法

table(sce.grun.hsc$protocol)
# 
# micro-dissected cells 
# 1546 
# sorted hematopoietic stem cells 
# 369 

# 再看一下各个样本与提取方法的对应关系
table(sce.grun.hsc$protocol,sce.grun.hsc$sample)

根据背景知识，大部分显微操作（micro-dissected）得到的细胞很多质量都较低，和我们的质控假设相违背，于是这里就不把它们纳入过滤条件

library(scater)
stats <- perCellQCMetrics(sce.grun.hsc)
# 只用sorted hematopoietic stem cells 计算过滤条件
qc <- quickPerCellQC(stats, batch=sce.grun.hsc$protocol,
    subset=grepl("sorted", sce.grun.hsc$protocol))

colSums(as.matrix(qc))
##   low_lib_size low_n_features        discard 
##            465            482            488

sce.grun.hsc <- sce.grun.hsc[,!qc$discard]

做个图看看

colData(unfiltered) <- cbind(colData(unfiltered), stats)
unfiltered$discard <- qc$discard

gridExtra::grid.arrange(
    plotColData(unfiltered, y="sum", x="sample", colour_by="discard", 
        other_fields="protocol") + scale_y_log10() + ggtitle("Total count") +
        facet_wrap(~protocol),
    plotColData(unfiltered, y="detected", x="sample", colour_by="discard",
        other_fields="protocol") + scale_y_log10() + 
        ggtitle("Detected features") + facet_wrap(~protocol),
    ncol=1
)

可以看到，大多数的显微操作技术得到的细胞文库都比较小，相比于细胞分选方法，它在提取过程中对细胞损伤较大

3 归一化

使用去卷积方法

library(scran)
set.seed(101000110)
clusters <- quickCluster(sce.grun.hsc)
sce.grun.hsc <- computeSumFactors(sce.grun.hsc, clusters=clusters)
sce.grun.hsc <- logNormCounts(sce.grun.hsc)

4 找表达量高变化基因

这里没有指定任何的批次，因为想保留这两种技术产生的任何差异

set.seed(00010101)
dec.grun.hsc <- modelGeneVarByPoisson(sce.grun.hsc) 
top.grun.hsc <- getTopHVGs(dec.grun.hsc, prop=0.1)

做个图

plot(dec.grun.hsc$mean, dec.grun.hsc$total, pch=16, cex=0.5,
    xlab="Mean of log-expression", ylab="Variance of log-expression")
curfit <- metadata(dec.grun.hsc)
curve(curfit$trend(x), col='dodgerblue', add=TRUE, lwd=2)

看到这个线有点“太平缓”，和之前见过的都不一样，感觉“中间少了一个峰”。这是因为细胞中的基因表达量都比较低，差别也不大【大家一起贫穷，于是贫富差距很小】，所以大部分细胞在纵坐标（衡量变化的方差）上体现不出来差距，也就导致了拟合的曲线不会有“峰”

可能会想，那为什么不是大家表达量都很高呢（大家都很富有，贫富差距不是也很小吗）？因为横坐标可以看到，从0-3.5，这个范围对于表达量来说确实很小，之前做的图有的都大于10、15

5 降维聚类

降维就采取最基础的方式：

set.seed(101010011)
sce.grun.hsc <- denoisePCA(sce.grun.hsc, technical=dec.grun.hsc, subset.row=top.grun.hsc)
sce.grun.hsc <- runTSNE(sce.grun.hsc, dimred="PCA")

# 检查PC的数量
ncol(reducedDim(sce.grun.hsc, "PCA"))
## [1] 9

聚类

snn.gr <- buildSNNGraph(sce.grun.hsc, use.dimred="PCA")
colLabels(sce.grun.hsc) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership)

table(colLabels(sce.grun.hsc))
## 
##   1   2   3   4   5   6   7   8   9  10  11  12 
## 259 148 221 103 177 108  48 122  98  63  62  18

作图

short <- ifelse(grepl("micro", sce.grun.hsc$protocol), "micro", "sorted")
gridExtra:::grid.arrange(
    plotTSNE(sce.grun.hsc, colour_by="label"),
    plotTSNE(sce.grun.hsc, colour_by=I(short)),
    ncol=2
)

由于没有去除两个技术批次的差异，所以这里分的很开

6 找marker基因

markers <- findMarkers(sce.grun.hsc, test.type="wilcox", direction="up",
    row.data=rowData(sce.grun.hsc)[,"SYMBOL",drop=FALSE])

检查一下cluster6的marker基因

chosen <- markers[['6']]
best <- chosen[chosen$Top <= 10,]
length(best)
# [1] 16

# 将cluster6与其他clusters对比的AUC结果提取出来
aucs <- getMarkerEffects(best, prefix="AUC")
rownames(aucs) <- best$SYMBOL

library(pheatmap)
pheatmap(aucs, color=viridis::plasma(100))

看到溶菌酶相关基因（LYZ家族）、Camp、 Lcn2、 Ltf 都上调，表明cluster6可能是神经元起源细胞

Grun et al. 2016