单细胞交响乐
  • 前言:我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇:背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇:文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了,你用过几种?
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法|2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA(co-varying neighborhood analysis)
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE:单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus,想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇:分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇:活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇:开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数?
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较:integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
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在本页
  • 1 前言
  • 数据准备
  • ID转换
  • 编辑样本信息
  • 2 质控
  • 3 归一化
  • 4 找表达量高变化基因
  • 5 降维聚类
  • 降维
  • 聚类
  • 检查聚类分群与批次
  • 6 补充矫正批次效应
  • 利用fastMNN矫正
  • 降维聚类

这有帮助吗?

  1. 4 实战篇:活学活用

4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞

刘小泽写于2020.7.20

上一页4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞下一页4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞

最后更新于4年前

这有帮助吗?

1 前言

这是也是来自多个供体的人类胰腺细胞,使用Smart-seq2建库技术,数据来自

数据准备

library(scRNAseq)
sce.seger <- SegerstolpePancreasData()
sce.seger
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 26179 3514 
# metadata(0):
#   assays(1): counts
# rownames(26179): SGIP1 AZIN2 ... BIVM-ERCC5 eGFP
# rowData names(2): symbol refseq
# colnames(3514): HP1502401_N13 HP1502401_D14 ...
# HP1526901T2D_O11 HP1526901T2D_A8
# colData names(8): Source Name individual ... age
# body mass index
# reducedDimNames(0):
#   altExpNames(1): ERCC

看到3500多个细胞,包含ERCC,使用Symbol ID

看下样本信息:

ID转换

选择的方式是:将没有匹配的NA去掉,并且去掉重复的行

# 首先得到symbol ID和对应的Ensembl ID(其中会存在无对应的NA情况)
library(AnnotationHub)
edb <- AnnotationHub()[["AH73881"]]
symbols <- rowData(sce.seger)$symbol
ens.id <- mapIds(edb, keys=symbols, keytype="SYMBOL", column="GENEID")

# 之前见到的方法是:
# keep <- !is.na(gene.ids) & !duplicated(gene.ids)

# 这里使用了另一种方法(不是直接将NA去掉,而且替换成了symbol)
ens.id <- ifelse(is.na(ens.id), symbols, ens.id)
keep <- !duplicated(ens.id)

sce.seger <- sce.seger[keep,]
rownames(sce.seger) <- ens.id[keep]

小结一下:至此见到了三种ID转换的方式,根据最后保留的基因数量,可以排个序:

保留基因最多(保留了NA和重复):uniquifyFeatureNames 中等(保留了NA,去掉重复):ifelse(is.na(ens.id), symbols, ens.id) 最少(去掉了NA以及重复):!is.na(gene.ids) & !duplicated(gene.ids)

编辑样本信息

之前有8列样本的信息,有点冗余了。这里只保留3列关心的,并重新命名

emtab.meta <- colData(sce.seger)[,c("cell type", 
    "individual", "single cell well quality")]
colnames(emtab.meta) <- c("CellType", "Donor", "Quality")
colData(sce.seger) <- emtab.meta

另外把细胞类型这一列中的“cell”字符去掉,并把首字母大写

sce.seger$CellType <- gsub(" cell", "", sce.seger$CellType)
sce.seger$CellType <- paste0(
    toupper(substr(sce.seger$CellType, 1, 1)),
    substring(sce.seger$CellType, 2))

2 质控

依然是备份一下,把unfiltered数据主要用在质控的探索上

unfiltered <- sce.seger

之前作者在数据中已经标注了细胞质量,可以看到有问题的细胞还是很多的:

table(sce.seger$Quality)
# 
# control, 2-cell well  control, empty well     low quality cell                   OK 
# 32                   96                 1177                 2209

因此就要注意了,这里的数据会不会满足“大部分细胞都是高质量的”这个假设?

还是需要试一下,看看结果先

library(scater)
stats <- perCellQCMetrics(sce.seger)
qc1 <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets="altexps_ERCC_percent",
                     batch=sce.seger$Donor)


colData(unfiltered) <- cbind(colData(unfiltered), stats)
unfiltered$discard <- qc1$discard

gridExtra::grid.arrange(
  plotColData(unfiltered, x="Donor", y="sum", colour_by="discard") +
    scale_y_log10() + ggtitle("Total count") +
    theme(axis.text.x = element_text(angle = 90)),
  plotColData(unfiltered, x="Donor", y="detected", colour_by="discard") +
    scale_y_log10() + ggtitle("Detected features") +
    theme(axis.text.x = element_text(angle = 90)),
  plotColData(unfiltered, x="Donor", y="altexps_ERCC_percent",
              colour_by="discard") + ggtitle("ERCC percent") +
    theme(axis.text.x = element_text(angle = 90)),
  ncol=3
)

看到HP1509101在过滤时存在过滤不完全的情况,HP1504901过滤的ERCC数量太多,推测这两个批次效果可能并不是很好,可能存在大量的低质量细胞

因此,再次指定subset 参数,重新画图

library(scater)
stats <- perCellQCMetrics(sce.seger)
qc <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets="altexps_ERCC_percent",
    batch=sce.seger$Donor,
    subset=!sce.seger$Donor %in% c("HP1504901", "HP1509101"))

看看过滤掉多少

colSums(as.matrix(qc))
##              low_lib_size            low_n_features high_altexps_ERCC_percent 
##                       788                      1056                      1031 
##                   discard 
##                      1246

最后将qc过滤的与本来标注低质量的一同过滤

low.qual <- sce.seger$Quality == "low quality cell"
sce.seger <- sce.seger[,!(qc$discard | low.qual)]

# 过滤了大概1500个细胞
> dim(unfiltered);dim(sce.seger)
[1] 26179  3514
[1] 26179  2090

3 归一化

此处会有一点小问题,值得注意!

本来有ERCC,操作应该是:

library(scran)
sce.seger  = computeSpikeFactors(sce.seger, "ERCC")
sce.seger <- logNormCounts(sce.seger) 
# Error in .local(x, ...) : size factors should be positive

但由于存在几个细胞中一个ERCC都没有,所以会报错

此时面临两个选择:要么把这几个细胞去掉;要么就不借助ERCC,用另一种去卷积方法

> table(colSums(counts(altExp(sce.seger)))==0)

FALSE  TRUE 
 2087     3

如果要去掉这几个细胞:

test=sce.seger[,!colSums(counts(altExp(sce.seger)))==0]
sce.test = computeSpikeFactors(test, "ERCC")
sce.test <- logNormCounts(test)

我们这里选择保守的方法,不去掉细胞,使用另一种去卷积方法:

clusters <- quickCluster(sce.seger)
sce.seger <- computeSumFactors(sce.seger, clusters=clusters)
sce.seger <- logNormCounts(sce.seger) 

summary(sizeFactors(sce.seger))
# Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
# 0.0000  0.1832  0.4016  1.0000  1.0996 12.9607

4 找表达量高变化基因

下面构建模型想使用modelGeneVarWithSpikes,于是首先应该把那几个没有ERCC的细胞去掉;另外由于AZ这个批次相对其他批次的细胞数量过于少,因此在模型构建中也把它去掉吧

for.hvg <- sce.seger[,librarySizeFactors(altExp(sce.seger)) > 0
    & sce.seger$Donor!="AZ"]
dec.seger <- modelGeneVarWithSpikes(for.hvg, "ERCC", block=for.hvg$Donor)
chosen.hvgs <- getTopHVGs(dec.seger, n=2000)

如果要批量作图检查的话

# 批次数量较多,因此设置多行多列显示
par(mfrow=c(3,3))
blocked.stats <- dec.seger$per.block
for (i in colnames(blocked.stats)) {
    current <- blocked.stats[[i]]
    plot(current$mean, current$total, main=i, pch=16, cex=0.5,
        xlab="Mean of log-expression", ylab="Variance of log-expression")
    curfit <- metadata(current)
    points(curfit$mean, curfit$var, col="red", pch=16)
    curve(curfit$trend(x), col='dodgerblue', add=TRUE, lwd=2)
}

注意,这里在找完HVGs后,没有进行批次矫正,如果继续向下做,会发现什么?

5 降维聚类

降维

library(BiocSingular)
set.seed(101011001)
sce.seger <- runPCA(sce.seger, subset_row=chosen.hvgs, ncomponents=25)
sce.seger <- runTSNE(sce.seger, dimred="PCA")

聚类

snn.gr <- buildSNNGraph(sce.seger, use.dimred="PCA")
colLabels(sce.seger) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership)

检查聚类分群与批次

tab <- table(Cluster=colLabels(sce.seger), Donor=sce.seger$Donor)
library(pheatmap)
pheatmap(log10(tab+10), color=viridis::viridis(100))

结果真的是:批次效应影响了分群,因此最好还是做一遍fastMNN操作

tSNE图中也是显示出了强烈的批次效应

gridExtra::grid.arrange(
    plotTSNE(sce.seger, colour_by="label"),
    plotTSNE(sce.seger, colour_by="Donor"),
    ncol=2
)

6 补充矫正批次效应

上图看到很明显的批次效应,那么如果处理后,会有什么不同吗?

利用fastMNN矫正

library(batchelor)
set.seed(1001010)
merged.seger <- fastMNN(sce.seger, subset.row=chosen.hvgs, 
                         batch=sce.seger$Donor)
merged.seger
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 2000 2090 
# metadata(2): merge.info pca.info
# assays(1): reconstructed
# rownames(2000): GCG TTR ... MAP6 LCP1
# rowData names(1): rotation
# colnames(2090): HP1502401_H13 HP1502401_J14 ...
# HP1526901T2D_N8 HP1526901T2D_A8
# colData names(2): batch label
# reducedDimNames(2): corrected TSNE
# altExpNames(0):

# metadata(merged.seger)$merge.info$lost.var
# lost.var :值越大表示丢失的真实生物异质性越多

因为fastMNN会包含PCA降维,所以下面继续进行tSNE即可

降维聚类

library(BiocSingular)
set.seed(101011001)
merged.seger <- runTSNE(merged.seger, dimred="corrected")

snn.gr <- buildSNNGraph(merged.seger, use.dimred="corrected")
colLabels(merged.seger) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership)

再次作图,是不是明显比之前好很多?

gridExtra::grid.arrange(
  plotTSNE(merged.seger, colour_by="label"),
  plotTSNE(merged.seger, colour_by="batch"),
  ncol=2
)
Segerstolpe et al. (2016)