# 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性 > 看这篇的原因是看到它的方法部分写的很详细，提供了很多参数可以参考。但是CNV和免疫部分我研究不深，所以下面也不会介绍很详细 ## 1 文章信息 题目：Single-cell analysis reveals new evolutionary complexity in uveal melanoma 发表日期：2020年1月24日 杂志：Nature Communications 文章在： DOI： 附件在： ![图1](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-031821.png) ## 2 摘要 葡萄膜黑色素瘤（UM）是一种高度转移性癌症，与皮肤黑色素瘤不同，它对免疫检查点疗法无反应。 > 葡萄膜恶性黑色素瘤是成年人中最多见的一种恶性眼内肿瘤，在国外其发病率占眼内肿瘤的首位，在国内则仅次于视网膜母细胞瘤，居眼内肿瘤的第二位。此瘤的恶性程度高，眼后极部是好发部位。**易经经血流转移，85%转移至肝脏，预后较差。** 作者使用来自**8个原位癌和3个转移癌样本的59,915个肿瘤和非肿瘤细胞**进行单细胞测序，来检查肿瘤微环境。肿瘤细胞展示了新的亚克隆细胞基因组复杂性和转录状态。 > 肿瘤微环境是一个动态网络，它包括肿瘤细胞、细胞外基质和间质组织等，是影响肿瘤转移的关键因素 肿瘤浸润免疫细胞检测到了之前无法识别的多种细胞类型，包括主要表达LAG3（一种免疫检查点的marker）而非PD-1或CTLA-4的CD8 + T细胞。 > 免疫检查点是指免疫系统的内在调控机制，可保持自身耐受性，并有助于避免在生理性免疫应答期间的附带损伤 免疫检查点抑制剂的前世今生： > > * CD4+ 或 CD8+ 的 T 细胞表面存在的一种免疫球蛋白，被称之为细胞毒性淋巴细胞抗原 4，亦称为CTLA-4。 CTLA-4 调节初始和记忆性 T 细胞的早期活化程度 > * 1992 年，日本学者 Ishida 从凋亡的小鼠 T 细胞杂交瘤 中发现了 PD-1。因其可令 T 细胞失活，将其命名为程序性死亡受体 1，亦称为PD-1。PD-1 主要限制慢性炎症、感染或癌症中的 T 细胞活性，从而限制自身免疫 V(D)J分析发现了克隆扩增的T细胞，表明它们能够发起免疫反应。 > Illumina的免疫学研究综述： > > B细胞和T细胞构成了免疫系统的适应性分支，并能够识别繁多的抗原。 与体细胞相比，B 细胞和 T 细胞是独特的，其发育和成熟是由生殖细胞系中未编码的 DNA 序列决定的。相反，在成熟过程中，这些细胞经历了**可变区（V）、多样区（D）和接合区（J）**基因片段的重排，以便形成独特的序列。 Class 1B UM的惰性肝转移被克隆扩增的浆细胞浸润，表明具有抗体介导的免疫 > UM分类参考： > > * Class 1A: Very low risk, with a 2% chance of the eye cancer spreading over the next five years > * Class 1B: Low risk, with a 21% chance of metastasis over five years; > * Class 2: High risk, with 72% odds of metastasis within five years. 最后，对于高危UM患者，LAG3可能为新的免疫检查点抑制剂研究提供思路 ## 3 方法 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-063543.png) ### **3.1 样本选择** 手术切除眼或肝后立即分离肿瘤区域的单细胞。转移性肿瘤组织特意从肿瘤-肝脏交界的远端选取，避免混入正常的肝脏组织。其余肿瘤组织样本则进行DecisionDx-UMseq的DNA和RNA分析 > DecisionDx-UM是一种预后测试，可准确判断与眼部黑色素瘤相关的转移风险 () ### **3.2 单细胞RNA测序** 总共11个样本，选择10X测序，样本编号与取样位点对应如图 ![样本编号与取样位点对应如图](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-095108.png) * UMM061, UMM062, UMM063, UMM064, UMM065, UMM066, UMM069, UMM067L, UMM041L以及BSSR0022样本使用三种文库制备方案：Chromium Single Cell 5’ Library & Gel Bead Kit v2、Chromium Single Cell V(D)J Human T Cell Enrichment Kit、Chromium Single Cell V(D)J Human B Cell Enrichment Kit。 * UMM059样本使用Chromium Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v2文库制备。 * 5’端文库可以捕获10,000细胞，3‘端文库(UMM059样本)可捕获5,000细胞。每个样本使用独立的Chromium Single Cell A Chip。3‘和5’基因表达文库使用 NextSeq 500测序，B细胞和T细胞的VDJ文库使用MiSeq测序 > 关于10x Genomics 建库流程，可以看： ### **3.3 单细胞DNA测序** UMM069 和 UMM041L样本使用Chromium Single Cell DNA Library & Gel Bead Kit + Chromium Single Cell C and D Chips进行文库制备，捕获500细胞。使用NextSeq 500测序 ### **3.4 DecisionDx-UMseq的DNA和RNA分析** 肿瘤RNA样本用来看基因表达量，DNA用来找变异 > Harbour, J. W., Chen, R. The DecisionDx-UM gene expression profile test provides risk stratification and individualized patient care in uveal melanoma. PLoS Curr. 5 (2013). ## 4 数据分析 ### **4.1 【重头戏】单细胞RNA分析** **4.1.1 上游：** 使用CellRanger (version 2.1.1)，利用`mkfastq`从原始的BCL文件得到FASTQ，然后`count`定量【比对到GRCh38 Ensembl build 84 genome (version 1.2.0）】。 **4.1.2 下游：基于R 3.5环境** 读入数据：11个样本的数据利用**Seurat2.3.4** 的 `Read10X()`读入，利用`aggregate` 进行整合。接着进行数据过滤（**标准是：UMI大于400, 每个细胞包含100-8000个基因，线粒体含量小于10%**）。没有进行样本批次矫正，**结果得到了59,915个细胞** 归一、标准化：利用`LogNormalize`进行归一化，设置`scale factor = 10,000`，然后利用`Scale.Data()`进行标准化，指定`vars.to.regress`去除UMI和线粒体对差异的影响。 细胞周期分析：利用`CellCycleScoring()` 【来自：Tirosh, I. et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science 352, 189–196 (2016).】 找高变化基因：设定范围是normalized expression 介于0.125 和 3；quantile-normalized variance 大于0.5，找到1865个高变化基因 降维：PCA前20个主成分 + tSNE （利用`RunTSNE()`） 寻找Doublets（一个孔出现两个细胞）：`DoubletFinder V2.0.2`【来自：McGinnis, C. S., Murrow, L. M. & Gartner, Z. J. DoubletFinder: doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8, 329–337.e4 (2019).】发现除巨噬细胞或单核细胞以外，很少会出现doublets（<10%） > 巨噬细胞 Macrophage：是一种位于组织内的白细胞，源自单核细胞 单核细胞 Monocyte：是人体免疫系统中的一种白细胞，单核细胞来源于骨髓中的前体细胞，在血管内为单核细胞，血管外就变成巨噬细胞 来自： > > 需要注意：两个细胞粘在一起这种Doublet现象，不一定是分析的假象。任何细胞都不是一个孤岛，在结核病和登革热发生时，单核细胞成为疾病的储存库，因此T细胞很有可能与单核细胞接触并形成doublet 来自：「在流式分析中排除doublet，我们可能做错了」 细胞亚群：利用`FindClusters()` ，使用前20个主成分，`resolution=3`，得到58个cluster。【下图：a图按来源划分；b图是全部的cluster】 ![a图按来源划分；b图是全部的cluster](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-064709.png) 然后用marker基因鉴定细胞类群： * Tumor cells：*MLANA*, *MITF*, and *DCT* * Tumor cell继续分：按照*PRAME* 和 gene expression profile (GEP)基因 * T Cells (*CD3D*, *CD3E*, *CD8A*) * B cells (*CD19*, *CD79A*, *MS4A1* \[*CD20*]) * Plasma cells (*IGHG1*, *MZB1*, *SDC1*, *CD79A*) * Monocytes and macrophages (*CD68*, *CD163*, *CD14*) * NK Cells (*FGFBP2*, *FCG3RA*, *CX3CR1*) * Retinal pigment epithelium (*RPE65*) * Photoreceptor cells (*RCVRN*) * Fibroblasts (*FGF7*) * Endothelial cells (*PECAM1*, *VWF*) ![image-20200505145144203](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-065144.png) 免疫细胞分析：利用`SubsetData()` 最后得到了16470个免疫细胞，经过归一化、找高变化基因（4423个）、PCA、tSNE（resolution=10），得到74个cluster，再传给`AverageExpression()`计算每个cluster的平均RNA表达量 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-141256.png) ### **4.2 单细胞CNV分析** 利用Cellranger DNA (version 1.0.0)的`mkfastq`将BCL转为fastq，利用`cnv` 得到CNV数据（中间过程需要比对到GRCh37 build 87 genome），结果可视化利用Loupe scDNA Browser (version 1.0.0)。 过滤掉免疫浸润以及非肿瘤细胞：设定subtree depth ### **4.3 inferCNV和克隆性分析** inferCNV： * `inferCNV`用于分析体细胞大规模染色体拷贝数变化(copy number alterations, CNA), 例如整条染色体或大片段染色体的增加或丢失(gain or deletions)。 * 原理：以一组"正常"细胞作为参考，分析肿瘤基因组上各个位置的基因表达量强度变化. 通过热图的形式展示每条染色体上的基因相对表达量 * 横坐标是各个基因在染色体的分布（染色体经过了排序），纵坐标是各个样本 * 表达量差异来源于肿瘤细胞的表达量减去正常细胞的表达量，红色部分表示这部分染色体区域的基因发生扩增，蓝色表示缺失 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-131024.png) UPhyloplot2：[https://github.com/harbourlab/UPhyloplot2，绘制肿瘤系统进化树](https://github.com/harbourlab/UPhyloplot2%EF%BC%8C%E7%BB%98%E5%88%B6%E8%82%BF%E7%98%A4%E7%B3%BB%E7%BB%9F%E8%BF%9B%E5%8C%96%E6%A0%91) ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-125500.png) ### **4.4 SCENIC 分析** 利用pySCENIC对8598个高质量UM细胞归一化后的表达矩阵进行计算，用GRNboost2进行基因调控网络重建。使用了24453个cisTarget Human motif database v9 motifs () ### **4.5 Monocle 2分析** 使用7947个高质量UM细胞 选轨迹推断基因：用`dispersionTable()`计算每个基因在细胞中的表达量相对于平均表达量的差异 结果可视化：`plot_cell_trajectory()`, `plot_complex_cell_trajectory()` ### **4.6 免疫细胞V(D)J 分析** 每个B细胞和T细胞文库的BCL文件也是用cellranger分析，先是`mkfastq`得到fastq，然后`vdj` pipeline： ## 5 结果 ### **5.1 单细胞RNA测序分析** 目的是探索单细胞水平的肿瘤微环境 对59915个细胞进行分群，发现既有肿瘤细胞又有非肿瘤细胞 从原位癌class1（左）到转移癌class2（右），细胞类型复杂度上升 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-121736.png) 另外用GEP clinical prognostic test 方法，看12个基因在细胞类群的表达，其中5个基因（EIF1B, HTR2B, ECM1, CDH1, and ROBO1）主要在肿瘤细胞表达，有一个（SATB1）主要在T细胞中表达，其余二者均有。表示GEP测试的准确性可能取决于从复杂的肿瘤微环境取样过程 > GEP clinical prognostic test : Harbour, J. W., Chen, R. The DecisionDx-UM gene expression profile test provides risk stratification and individualized patient care in uveal melanoma. PLoS Curr. 5 (2013) ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-122647.png) ### **5.2 转录轨迹分析** 目的是探索UM细胞的转录状态。 SCENIC的结果是： class2中富集到了肿瘤蛋白基因MYC、JUN，bHLH-PAS缺氧相关转录因子ARNT ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-132207.png) 然后monocle2拟时序分析，得到了16种状态，主要分成2支（class1 和class2） ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-132720.png) class1的细胞主要在1-4、14-16状态，class2主要在5-13，表示UM的整体分子特征主要就体现在class1和class2中 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-133214.png) 然后又用branched expression analysis modeling (BEAM) 和层次聚类的方法得到cluster，并且鉴定在不同状态富集的基因 下图是其中一个样本的结果（每个样本都进行了同样的操作），a是定量拟时序，b是细胞状态拟时序，c是亚克隆的拟时序，d是4个基因（JUN, MITF, HLA-A, and MYC）表达量的拟时序【这4个基因分别对应4种不同状态：TNFA/NFKB, differentiation, HLA/immune, and MYC】，e是细胞周期拟时序 可以看到单个样本中，这些转录状态在亚克隆和各个细胞周期中都有分布 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-135311.png) 整合的结果如下： ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-133438.png) ### **5.3 免疫细胞V(D)J 分析** 肿瘤微环境中9441个免疫细胞，分群如下： ![image-20200505221037964](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-141038.png)e 每个免疫细胞cluster的平均RNA表达量： ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-141505.png) 每个肿瘤样本免疫细胞中各个亚型占比：T细胞在所有样本都有体现，包括CD8+ cytotoxic T细胞、CD8+ T effector memory细胞，大部分T细胞都是CD8+，少部分是CD4+（包括：follicular helper cells, FOXP3+ regulatory cells, naïve lymphocytes） ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-141611.png) 单细胞VDJ结果：克隆扩增T细胞只存在于3个样本中 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-141734.png) CD8+ T cell expression of exhaustion-associated immune checkpoint molecules is strongest for LAG3, variable for TIGIT, and minimal for PDCD1 (PD1), CTLA4, HAVCR2 (TIM3), and TNFRSF9 ![](https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-05-05-144318.png) ## 6 意义 Class1 UM的潜伏期长和转移率低可能是由于免疫监视，而免疫监视可能是由EIF1AX和SF3B1突变产生的新抗原引起的。 这种可能性可能具有临床意义，值得进一步研究。 scRNA-seq V（D）J分析显示UM样品中克隆扩增的T细胞或浆细胞表明肿瘤浸润的免疫细胞能够引发反应，表明肿瘤突变程度低并不是UMs对检查点抑制剂反应差的唯一原因。 发现LAG3是UM中的主要衰竭指标，至少可以部分解释先前针对CTLA4和PD1的检查点抑制的失败。 LAG3是第三个针对患者的免疫抑制受体，表现出与PD1的显着协同作用，不仅在CD8 + T细胞上表达，而且在NK细胞和调节性T细胞上表达，并且具有独特的特性，可以显著扩大检查点抑制剂疗法的疗效。 因此，LAG3抑制剂正在多种癌症的大量临床试验中进行评估。