单细胞交响乐
  • 前言:我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇:背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇:文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了,你用过几种?
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法|2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA(co-varying neighborhood analysis)
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE:单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus,想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇:分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇:活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇:开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数?
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较:integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
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在本页
  • 1 前言
  • 数据准备
  • ID转换
  • 2 质控
  • 3 归一化
  • 4 找表达量高变化基因
  • 5 【尝试】矫正批次
  • 5 降维聚类
  • 降维
  • 聚类
  • 最后看看批次效应

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  1. 4 实战篇:活学活用

4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞

刘小泽写于2020.7.20

上一页4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞下一页4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞

最后更新于4年前

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1 前言

这次使用的数据是:中的不同人类供体的胰腺细胞

SMARTer其实不是个像Fluidigm、10X一样的制备系统,它是一个试剂盒。SMART技术是Clontech(Takara旗下全资子公司)的专利技术,2009年升级为SAMRTer技术后,采用更灵敏的SMARTer Oligo和高效的SMARTScribe RT进行逆转录,使其灵敏度提高至皮克级。利用SMARTer技术只需单管、单酶即可完成逆转录,无需接头连接,减少了样品操作步骤,也极大降低了样品损失,保留了原始信息,为RNA-Seq提供了可靠的基础。

2013年 Clontech公司就为Fluidigm的C1单细胞全自动制备系统推出了SMARTer Ultra Low RNA Kit。当时也是能够从C1捕获的单细胞中产生mRNA-seq文库,方便了研究。Fluidigm在C1平台上检验了多款试剂盒,发现SMARTer cDNA合成是最可靠的方法之一

参考:

后来很多平台也在使用SMARTer试剂(如WaferGen ICELL8 Single-Cell System),不过后来发现Smart-seq2的扩增效果优于SMARTer试剂盒,而且Smart-seq2技术比传统的SMARTer方法能产生更长和更多的cDNA,在低表达量时,Smart-seq2比SMARTer的基因检出率更高,结果更稳定

数据准备

library(scRNAseq)
sce.lawlor <- LawlorPancreasData()
sce.lawlor
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 26616 638 
# metadata(0):
#   assays(1): counts
# rownames(26616): ENSG00000229483 ENSG00000232849 ...
# ENSG00000251576 ENSG00000082898
# rowData names(0):
#   colnames(638): 10th_C10_S104 10th_C11_S96 ...
# 9th-C96_S81 9th-C9_S13
# colData names(8): title age ... race Sex
# reducedDimNames(0):
#   altExpNames(0):

ID转换

library(AnnotationHub)
edb <- AnnotationHub()[["AH73881"]]
anno <- select(edb, keys=rownames(sce.lawlor), keytype="GENEID", 
    columns=c("SYMBOL", "SEQNAME"))
rowData(sce.lawlor) <- anno[match(rownames(sce.lawlor), anno[,1]),-1]
rowData(sce.lawlor)
# DataFrame with 26616 rows and 2 columns
# SYMBOL     SEQNAME
# <character> <character>
#   ENSG00000229483   LINC00362          13
# ENSG00000232849   LINC00363          13
# ENSG00000229558    SACS-AS1          13
# ENSG00000232977   LINC00327          13
# ENSG00000227893   LINC00352          13
# ...                     ...         ...
# ENSG00000232746   LINC02022           3
# ENSG00000150867     PIP4K2A          10
# ENSG00000255021  AC093496.1           3
# ENSG00000251576   LINC01267           3
# ENSG00000082898        XPO1           2

2 质控

依然是备份一下,把unfiltered数据主要用在质控的探索上

unfiltered <- sce.lawlor

检查是否有线粒体基因和批次信息

# 其中有MT基因
table(rowData(sce.lawlor)$SEQNAME=="MT")
# 
# FALSE  TRUE 
# 25269    13 

# 还有一些批次信息
table(sce.lawlor$`islet unos id`)
# 
# ACCG268 ACCR015A ACEK420A  ACEL337  ACHY057  ACIB065  ACIW009  ACJV399 
# 136       57       45      103       39       57       93      108

进行质控

stats <- perCellQCMetrics(sce.lawlor, 
    subsets=list(Mito=which(rowData(sce.lawlor)$SEQNAME=="MT")))
qc <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets="subsets_Mito_percent",
    batch=sce.lawlor$`islet unos id`)
# 过滤了34个细胞
table(qc$discard)
# 
# FALSE  TRUE 
# 604    34 

sce.lawlor <- sce.lawlor[,!qc$discard]

看看过滤掉多少

colSums(as.matrix(qc))
# low_lib_size            low_n_features high_subsets_Mito_percent                   discard 
# 9                         5                        25                        34

作图看一下

colData(unfiltered) <- cbind(colData(unfiltered), stats)
unfiltered$discard <- qc$discard

gridExtra::grid.arrange(
    plotColData(unfiltered, x="islet unos id", y="sum", colour_by="discard") +
        scale_y_log10() + ggtitle("Total count") +
        theme(axis.text.x = element_text(angle = 90)),
    plotColData(unfiltered, x="islet unos id", y="detected", 
        colour_by="discard") + scale_y_log10() + ggtitle("Detected features") +
        theme(axis.text.x = element_text(angle = 90)), 
    plotColData(unfiltered, x="islet unos id", y="subsets_Mito_percent",
        colour_by="discard") + ggtitle("Mito percent") +
        theme(axis.text.x = element_text(angle = 90)),
    ncol=2
)

看一下文库大小和线粒体占比的关系

plotColData(unfiltered, x="sum", y="subsets_Mito_percent",
    colour_by="discard") + scale_x_log10()

最后把过滤条件应用在原数据

sce.lawlor <- sce.lawlor[,!qc$discard]

3 归一化

继续使用去卷积方法

library(scran)
set.seed(1000)
clusters <- quickCluster(sce.lawlor)
sce.lawlor <- computeSumFactors(sce.lawlor, clusters=clusters)
sce.lawlor <- logNormCounts(sce.lawlor)

summary(sizeFactors(sce.lawlor))
# Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
# 0.2955  0.7807  0.9633  1.0000  1.1820  2.6287

4 找表达量高变化基因

这里没有ERCC也没有UMI,所以就用最基础的方法构建模型:modelGeneVar

不过还是要指定批次信息

dec.lawlor <- modelGeneVar(sce.lawlor, block=sce.lawlor$`islet unos id`)
chosen.genes <- getTopHVGs(dec.lawlor, n=2000)

5 【尝试】矫正批次

这里写“尝试”是因为这里有一个问题:细胞总数不多,才600个,但批次的数量很多,所以归到单独的批次上细胞数就很少。这时如果继续矫正批次,不知道会不会抹除一些真实的生物学特性。

归根结底,还是一个技术噪音与生物因素之间的取舍问题

table(sce.lawlor$`islet unos id`)
# 
# ACCG268 ACCR015A ACEK420A  ACEL337  ACHY057  ACIB065  ACIW009  ACJV399 
# 136       57       45      103       39       57       93      108

所以可以尝试一下:

library(batchelor)
set.seed(1001010)
merged.lawlor <- fastMNN(sce.lawlor, subset.row=chosen.genes, 
                         batch=sce.lawlor$`islet unos id`)

metadata(merged.lawlor)$merge.info$lost.var

关于这个结果:lost.var ,值越大表示丢失的真实生物异质性越多

  • It contains a matrix of the variance lost in each batch (column) at each merge step (row).

  • Large proportions of lost variance (>10%) suggest that correction is removing genuine biological heterogeneity.

看到的确有损失生物异质性的可能性,那么就先放弃这个计划,直接进行下面的降维

5 降维聚类

降维

library(BiocSingular)
set.seed(101011001)
sce.lawlor <- runPCA(sce.lawlor, subset_row=chosen.genes, ncomponents=25)
sce.lawlor <- runTSNE(sce.lawlor, dimred="PCA")

聚类

snn.gr <- buildSNNGraph(sce.lawlor, use.dimred="PCA")
colLabels(sce.lawlor) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership)

看分群与细胞类型之间关系

tab <- table(colLabels(sce.lawlor), sce.lawlor$`cell type`)
library(pheatmap)
pheatmap(log10(tab+10), color=viridis::viridis(100))

看分群与批次之间

tab2 <- table(colLabels(sce.lawlor), sce.lawlor$`islet unos id`)
library(pheatmap)
pheatmap(log10(tab2+10), color=viridis::viridis(100))

最后看看批次效应

gridExtra::grid.arrange(
    plotTSNE(sce.lawlor, colour_by="label"),
    plotTSNE(sce.lawlor, colour_by="islet unos id"),
    ncol=2
)
Lawlor et al. (2017)
http://www.ebiotrade.com/newsf/2013-9/20139493414227.htm