单细胞交响乐
  • 前言:我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇:背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇:文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了,你用过几种?
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法|2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA(co-varying neighborhood analysis)
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE:单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus,想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇:分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇:活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇:开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数?
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较:integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
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在本页
  • 1 前言
  • 数据准备
  • ID转换
  • 2 质控
  • 3 归一化
  • 4 找表达量高变化基因
  • 5 矫正批次效应
  • 6 降维+聚类
  • 降维
  • 聚类
  • 最后检查一下供体的批次效应

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  1. 4 实战篇:活学活用

4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞

刘小泽写于2020.7.20

上一页4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞下一页4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞

最后更新于4年前

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1 前言

这次使用的数据是: 中的不同人类供体的胰腺细胞,和上一次相比使用的是更早期的CEL-seq。整体操作和上次CEL-seq2类似

数据准备

library(scRNAseq)
sce.muraro <- MuraroPancreasData()
sce.muraro
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 19059 3072 
# metadata(0):
#   assays(1): counts
# rownames(19059): A1BG-AS1__chr19 A1BG__chr19 ...
# ZZEF1__chr17 ZZZ3__chr1
# rowData names(2): symbol chr
# colnames(3072): D28-1_1 D28-1_2 ... D30-8_95
# D30-8_96
# colData names(3): label donor plate
# reducedDimNames(0):
#   altExpNames(1): ERCC

这次有4个供体

table(sce.muraro$donor)
# 
# D28 D29 D30 D31 
# 768 768 768 768

不过这个基因命名很奇怪,它全部加上了染色体编号

> head(rownames(sce.muraro))
[1] "A1BG-AS1__chr19" "A1BG__chr19"     "A1CF__chr10"    
[4] "A2M-AS1__chr12"  "A2ML1__chr12"    "A2M__chr12"

ID转换

选择的方式是:将没有匹配的NA去掉,并且去掉重复的行

由于基因名很奇怪,所以需要把__chr及后面的去掉

library(AnnotationHub)
edb <- AnnotationHub()[["AH73881"]]
gene.symb <- sub("__chr.*$", "", rownames(sce.muraro))
gene.ids <- mapIds(edb, keys=gene.symb, 
    keytype="SYMBOL", column="GENEID")

keep <- !is.na(gene.ids) & !duplicated(gene.ids)
# 过滤掉2000多基因
> table(keep)
keep
FALSE  TRUE 
 2119 16940 

sce.muraro <- sce.muraro[keep,]
rownames(sce.muraro) <- gene.ids[keep]

2 质控

依然是备份一下,把unfiltered数据主要用在质控的探索上

unfiltered <- sce.muraro

和上一次一样,如果只是针对ERCC和全部的批次进行质控,结果是

很明显,这个D28个捣鬼,钻了我们“大部分细胞都是高质量”的假设漏洞

因此,在过滤时不能考虑这个D28

library(scater)
stats <- perCellQCMetrics(sce.muraro)
qc <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets="altexps_ERCC_percent",
    batch=sce.muraro$donor, subset=sce.muraro$donor!="D28")

看看过滤掉多少

colSums(as.matrix(qc))
# low_lib_size            low_n_features high_altexps_ERCC_percent                   discard 
# 663                       700                       738                       773

最后把过滤条件应用在原数据

sce.muraro <- sce.muraro[,!qc$discard]

3 归一化

继续使用去卷积方法

library(scran)
set.seed(1000)
clusters <- quickCluster(sce.muraro)
sce.muraro <- computeSumFactors(sce.muraro, clusters=clusters)
sce.muraro <- logNormCounts(sce.muraro)

summary(sizeFactors(sce.muraro))
# Min.  1st Qu.   Median     Mean  3rd Qu.     Max. 
# 0.08782  0.54109  0.82081  1.00000  1.21079 13.98692

4 找表达量高变化基因

再看一眼数据,发现其中有plate和donor信息,它们都是与批次相关的

sce.muraro
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 16940 2299 
# metadata(0):
#   assays(2): counts logcounts
# rownames(16940): ENSG00000268895 ENSG00000121410 ...
# ENSG00000159840 ENSG00000074755
# rowData names(2): symbol chr
# colnames(2299): D28-1_1 D28-1_2 ... D30-8_93
# D30-8_94
# colData names(4): label donor plate sizeFactor
# reducedDimNames(0):
#   altExpNames(1): ERCC

table(sce.muraro$donor)
# 
# D28 D29 D30 D31 
# 333 601 676 689 
table(sce.muraro$plate)
# 
# 1   2   3   4   5   6   7   8 
# 281 292 292 295 282 285 283 289

因此就把这二者结合作为批次信息,依然是使用针对ERCC的构建模型方法

block <- paste0(sce.muraro$plate, "_", sce.muraro$donor)
dec.muraro <- modelGeneVarWithSpikes(sce.muraro, "ERCC", block=block)
top.muraro <- getTopHVGs(dec.muraro, prop=0.1)

5 矫正批次效应

library(batchelor)
set.seed(1001010)
merged.muraro <- fastMNN(sce.muraro, subset.row=top.muraro, 
    batch=sce.muraro$donor)

metadata(merged.muraro)$merge.info$lost.var
##           D28      D29      D30     D31
## [1,] 0.060847 0.024121 0.000000 0.00000
## [2,] 0.002646 0.003018 0.062421 0.00000
## [3,] 0.003449 0.002641 0.002598 0.08162

6 降维+聚类

降维

set.seed(100111)
# 前面矫正过批次效应,所以这里指定参数dimred: specifying the existing dimensionality reduction results to use
merged.muraro <- runTSNE(merged.muraro, dimred="corrected")

聚类

snn.gr <- buildSNNGraph(merged.muraro, use.dimred="corrected")
colLabels(merged.muraro) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership)

如果想看一下这里的分群和之前的批次之间的关系:

Tip:如果感觉批次或分群数量太多,看着效果不好,可以用热图的形式展示:

tab <- table(Cluster=colLabels(merged.muraro), CellType=sce.muraro$label)
library(pheatmap)
pheatmap(log10(tab+10), color=viridis::viridis(100))

最后检查一下供体的批次效应

gridExtra::grid.arrange(
    plotTSNE(merged.muraro, colour_by="label"),
    plotTSNE(merged.muraro, colour_by="batch"),
    ncol=2
)
Muraro et al. (2016)