5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果

刘小泽写于19.5.13

CellRanger count出来的结果，怎么看？这次是作为了解的内容

Cellranger的结果力求与常规分析的结果格式相同，比如它生成的 barcoded BAM files 也可以放到IGV中查看比对质量

count结果一般放在out目录下，主要有summary和analysis两大类，包含以下几项：

图1

Summary

这是一个html格式的文件，直接下载到本地打开

打开时就能对数据进行一个判断，网页顶端颜色显示为黄色或者红色说明数据存在异常

图2

然后点击Details，可以看到为何数据出错：

图3

结果部分包括实验捕获的细胞数目、检测到的基因数目、测序数据的产出与质量统计、参考基因组的比对情况

(第一张为V2试剂的结果)

图4

(第二张为V3试剂的结果)

图5

几个指标可以关注一下：

• 左上部分中，包括了reads数、barcodes数、UMI、index、Q30等统计值

• 左下是reads比对的比例，包括基因间区、外显子、内含子，如果比对率太低(一般认为外显子的比对率要在60%以上)

• 右上图是利用barcodes上的UMI标签分布来估计细胞数，绿/蓝色表示细胞，灰色表示背景，其中Y轴表示每个barcode对应的UMI数量，X轴是一定数量的UMI序列所对应barcode的数量，比如上图中有1000个barcodes含有10k个UMI，细胞过滤就是通过这个图来展示的。

  首先明确，barcode用来区分细胞，UMI用来区分转录本；其次，barcodes数量时要大于细胞数量的（以保证每个细胞都会有barcode来进行区分）如果图线陡降说明

下面👇是在对原文数据进行count时遇到的一个问题，记录下来

原文的小坑

其实有了参考信息与原始序列，跑一个count命令并不难，但是对于这篇文章来讲，有一个小坑需要注意：看原文的方法描述

图6

原文是需要将hg38和Merkel cell polyomavirus, MCPyV(默克尔细胞多瘤病毒)的基因组共同作为参考序列去比对，基本操作流程类似这样：

图7

其中，hg38的fasta与gtf获取比较容易，直接下载即可(具体见"单细胞实战—四")，但是作者还用到了这个MCPyV，它的基因组也是比较容易获得https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010277，但是**gtf怎么获得**是个问题，作者给出的解答是：需要用基因组fasta自己生成gtf文件

图8

这个思路很重要，但是如何将基因组fasta转为gtf，还是个问题，于是本着"自己的锅自己背"的原则，又去问了作者

图9

本以为人家不会给回信息，因为问的问题好像有点和他们文章没什么关系了，但他真的回信了并且很负责告诉我："他也不会！"，解决办法就是：手动构建一个

其实这个事情可以告诉我们，复现文章中遇到问题时，直接和原作者沟通是最有效的方式（这是我第一次和一作直接进行交流）。之前的时间都是自己在摸不着头脑地进行各种尝试，然后找代码，结果都不可以成功

先把基因组序列下载下来

图10

然后根据genbank的序列信息，造出5个CDS的注释信息

图11

基本就按照这个样子来就好，不需要很复杂

需要注意的是，cellranger只能识别exon，所以我们也要这样设计

图12

# 每一行有9列tab分隔信息
# 第一列：Chromosome 指定基因组上染色体或contig位置
# 第二列：Source 这个用处不大
# 第三列：Feature CellRanger软件只取exon的部分
# 第四列：Start 起始位点(1-based)
# 第五列：End 终止位点(1-based)
# 第六列：Score 这个用处不大，建议用"."表示
# 第七列：Strand feature信息在基因组的+或-链
# 第八列：Frame 用处不大，建议“.”
# 第九列：分号分隔的键值对，重点是transcript_id 和gene_id。gene_name可选
ADE45414.1_1     Gnomon  exon    465    1190    .       -       .       gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45415.1_2     Gnomon  exon    1156   2427    .       -       .       gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45416.1_3     Gnomon  exon    2503   4722    .       -       .       gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45416.1_3     Gnomon  exon    5154   5387    .       -       .       gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45417.1_4     Gnomon  exon    4827   5387    .       -       .       gene_id "1"; transcript_id "1.1";

但是自己构建时，一定要注意使用tab分隔，即使看上去像也不可信，检查的方法有两个：

一个是直接运行cellranger mkgtf 看是否报错，可能会提示：GTF的行数不对；

另一个是直接检查：awk -F '\t' '{print NF}' mcv.gtf，如果显示1，那么说明没有tab分隔，而是用的多个空格，利用sed可以把这些空格替换成tab：

sed 's/ \+ /\t/g' inputfile > outputfile