scRNA中，doublets指的就是一个文库中存在两个细胞的情况 。一般是由于技术误差导致的（比如细胞分选、捕获），尤其在包含几千个细胞的基于液滴的技术中比较突出 (Zheng et al. 2017arrow-up-right )。它干扰了对单个细胞表达量以及细胞形态的判断，比如一个液滴中有两个细胞，会通过误导我们这个细胞可能处于分化的“过渡态”。因此检测和去除这部分的影响至关重要。
一个比较通用的检测方法是：单纯根据表达量(Dahlin et al. 2018arrow-up-right )。下面将利用一个10X数据来展示两种检测方法，它们的主要区别是我们是否需要提前知道分群的信息
复制 #--- loading ---#
library ( scRNAseq )
sce.mam <- BachMammaryData ( samples = "G_1" )
#--- gene-annotation ---#
library ( scater )
rownames ( sce.mam ) <- uniquifyFeatureNames (
rowData ( sce.mam ) $ Ensembl , rowData ( sce.mam ) $ Symbol )
library ( AnnotationHub )
ens.mm.v97 <- AnnotationHub ()[[ "AH73905" ]]
rowData ( sce.mam ) $ SEQNAME <- mapIds ( ens.mm.v97 , keys = rowData ( sce.mam ) $ Ensembl ,
keytype = "GENEID" , column = "SEQNAME" )
#--- quality-control ---#
is.mito <- rowData ( sce.mam ) $ SEQNAME == "MT"
stats <- perCellQCMetrics ( sce.mam , subsets = list ( Mito = which ( is.mito )))
qc <- quickPerCellQC ( stats , percent_subsets = "subsets_Mito_percent" )
sce.mam <- sce.mam [ ,! qc $ discard ]
#--- normalization ---#
library ( scran )
set.seed ( 101000110 )
clusters <- quickCluster ( sce.mam )
sce.mam <- computeSumFactors ( sce.mam , clusters = clusters )
sce.mam <- logNormCounts ( sce.mam )
#--- variance-modelling ---#
set.seed ( 00010101 )
dec.mam <- modelGeneVarByPoisson ( sce.mam )
top.mam <- getTopHVGs ( dec.mam , prop = 0.1 )
#--- dimensionality-reduction ---#
library ( BiocSingular )
set.seed ( 101010011 )
sce.mam <- denoisePCA ( sce.mam , technical = dec.mam , subset.row = top.mam )
sce.mam <- runTSNE ( sce.mam , dimred = "PCA" )
#--- clustering ---#
snn.gr <- buildSNNGraph ( sce.mam , use.dimred = "PCA" , k = 25 )
colLabels ( sce.mam ) <- factor ( igraph :: cluster_walktrap ( snn.gr ) $ membership )
sce.mam
## class: SingleCellExperiment
## dim: 27998 2772
## metadata(0):
## assays(2): counts logcounts
## rownames(27998): Xkr4 Gm1992 ... Vmn2r122 CAAA01147332.1
## rowData names(3): Ensembl Symbol SEQNAME
## colnames: NULL
## colData names(5): Barcode Sample Condition sizeFactor label
## reducedDimNames(2): PCA TSNE
## altExpNames(0): 或者直接加载分享的数据arrow-up-right
使用doubletCluster() 将任一cluster与其他另外两个clusters的表达量进行比较，即3个cluser为一组，其中一个是query，另外两个是source。基于的原假设是：query cluster的细胞中如果包含doublet，那么它是来自两个source clusters。 (Bach et al. 2017arrow-up-right )
参考帮助文档，它的具体做法是： For each “query” cluster, we examine all possible pairs of “source” clusters, hypothesizing that the query consists of doublets formed from the two sources .
If so, gene expression in the query cluster should be strictly intermediate between the two sources after library size normalization.
返回的结果包括：
基因数量N：query cluster与另外两个source cluster相比特有的差异基因，它的数量多少可以为拒绝原假设提供依据。这个基因数量越少，query越有可能是doublets
文库大小比例 lib.size：每个source cluster的各个细胞文库大小中位数 / query cluster中的各个细胞文库大小中位数，因此两个source就对应两个lib.size。我们知道doublets是一个文库包含两个细胞，因此它会比单个细胞的文库更大。这个值越小，query越可能是doublets
占全部细胞的百分比 prop：query中的细胞数量占全部细胞的百分比，一般这个值小于5%，不过也取决于10X机器上样的数量
最后主要还是看N的数量，可以将这个结果按照N排个序
挑出来怀疑对象，可以对cluster6进一步检查
比如找到cluster6的marker基因
看到这个cluster的marker基因，是不是在它的source cluster（即cluster1、2）中也有类似的表达模式？
另外，基于背景知识，没有细胞会同时表达basal cells (Acta2 ) and alveolar cells (Csn2 ) 这两个基因，但是看到cluster6中这两个基因表达量都较高，再一次证明了我们的假设：cluster6是一个doublet混合体，而不是纯粹的一个细胞类型
注意
从上面也能看到，doubletCluster()的优点就是方便操作，并且结果比较好理解。一旦有怀疑的cluster，就可以立即检查。但缺点是高度依赖分群的质量，如果分群不好，那么这个结果的可信度就会大打折扣。另外，如果真的有某个亚群中细胞数量很少，带来的结果就是：N小，让这个亚群很有可能成为怀疑对象。
不过，随着scRNA的技术改进，这个doublets情况会逐渐好转
将利用来自scran包的doubletCells() ，它基于的假设是：模拟的doublets和真实的doublets接近
它的算法是：
随机选取两个原始单细胞表达量，加和，当做一个模拟的doublet，这样操作上千次
对每一个原始细胞，看看它附近有多少的模拟的doublet，并计算密度
对每一个原始细胞，同时计算它附近的其他原始细胞的数量，并计算密度
对每一个细胞，计算两个密度的比值，作为“doublet score”
为了加快密度的计算，这个函数会进行一个PCA以及log转换
然后把计算结果的doublet score画出来，数值较高的细胞聚成一团
同时，结合之前doubletCluster()的结果看一眼：多么明显的cluster6！
注意
doubletCells() 的优点就是不需要依赖分群结果，降低了分群的影响。缺点是需要对doublets的模拟更精确，真的要保证它和真实的情况接近。
另外简单去掉那些doublet scores较高的细胞有时也是不够的，例如一个潜在的doublet cluster中只有一小部分的分值高，去掉它们剩下的细胞依然会干扰判断。那么问题来了，怎么样才叫高的doublet scores呢？是不是得设置一个阈值？ 就像刚才这种情况，如果把阈值降低会不会就多包括了一些潜在的doublets呢？其实这也是生信中的一个比较头疼的问题，没有一个固定的阈值或者范围，一切都是相对的。
比较推荐的方法是将doubletCells() 的结果再用分群展示出来，就像上面的图，可以更直观看到那些细胞影响较大。
检测doublet操作必须要求数据来自同一批次，因为doublet也不会来自两次捕获的细胞，它毕竟是一个文库，只是包含两个细胞，因此也不需要担心检测doublet时怎么去除批次效应之类的问题。最好还是在分析前最好先清楚实验设计
如果数据中包含了细胞分化轨迹的信息，doublet就不好判断了，因为处于变化状态的细胞就很像doublet，容易被误认
