单细胞交响乐
  • 前言:我与《单细胞交响乐》的缘分
  • 1 准备篇:背景知识
    • 1.1 数据结构
    • 1.2 总览 | 从实验到分析
  • 2 积累篇:文献阅读
    • 2.1.1 综述 | 2019-单细胞转录组分析最佳思路
    • 2.1.2 综述 | 2018-单细胞捕获平台
    • 2.1.3 综述 | 2017-scRNA中的细胞聚类分群
    • 2.1.4 综述 | scRNA已经开发出超过1000款工具了,你用过几种?
    • 2.1.5 综述 | 2021-单细胞测序的微流控技术应用
    • 2.2.1 研究 | 2018-单细胞转录组探索癌症免疫治疗获得性抗性机理
    • 2.2.2 研究 | 2018-人类结直肠癌单细胞多组学分析
    • 2.2.3 研究 | 2020-单细胞分析揭示葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性
    • 2.2.4 研究 | 2020-COVID-19病人支气管免疫细胞单细胞测序分析
    • 2.2.5 研究 | 2020-原汁原味读--单细胞肿瘤免疫图谱
    • 2.2.6 研究 | 2021-多发性骨髓瘤发展过程中肿瘤和免疫细胞的共同进化
    • 2.2.7 研究 | 2021-多个组织的成纤维细胞图谱
    • 2.2.8 研究 | 2021-多组学分析肺结核队列的记忆T细胞状态
    • 2.2.9 研究 | 2021-CancerSCEM: 人类癌症单细胞表达图谱数据库
    • 2.2.10 研究| 2021-单细胞转录组分析COVID-19重症患者肺泡巨噬细胞亚型
    • 2.2.11 研究 |2021-单细胞转录组揭示肺腺癌特有的肿瘤微环境
    • 2.2.12 研究 | 2021-单细胞转录组揭示乳头状甲状腺癌起始与发展
    • 2.2.13 研究 | 2021-解析食管鳞癌化疗病人的单细胞转录组
    • 2.2.14 研究 | 2021-单细胞水平看骨髓瘤的细胞状态和基因调控
    • 2.3.1 算法|2020-BatchBench比较scRNA批次矫正方法
    • 2.3.2 算法 | 2021-scPhere——用地球仪来展示降维结果
    • 2.3.3 算法 | 2021-单细胞差异分析方法评测
    • 2.3.4 算法 | 2021-细胞分群新方法——CNA(co-varying neighborhood analysis)
    • 2.3.5 工具 | 2018-iSEE:单细胞数据可视化辅助网页工具
    • 2.3.6 工具 | 2021-MACA: 一款自动注释细胞类型的工具
    • 2.3.7 工具 | 2021-一个很有想法的工具——Ikarus,想要在单细胞水平直接鉴定肿瘤细胞
  • 3 流程篇:分析框架
    • 3.1 质控
    • 3.2 归一化
    • 3.3 挑选表达量高变化基因
    • 3.4 降维
    • 3.5 聚类
    • 3.6 Marker/标记基因检测
    • 3.7 细胞类型注释
    • 3.8 批次效应处理
    • 3.9 多样本间差异分析
    • 3.10 检测Doublet
    • 3.11 细胞周期推断
    • 3.12 细胞轨迹推断
    • 3.13 与蛋白丰度信息结合
    • 3.14 处理大型数据
    • 3.15 不同R包数据的相互转换
  • 4 实战篇:活学活用
    • 4.1 实战一 | Smart-seq2 | 小鼠骨髓
    • 4.2 实战二 | STRT-Seq | 小鼠大脑
    • 4.3 实战三 | 10X | 未过滤的PBMC
    • 4.4 实战四 | 10X | 过滤后的PBMC
    • 4.5 实战五 | CEL-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.6 实战六 | CEL-seq | 人胰腺细胞
    • 4.7 实战七 | SMARTer | 人胰腺细胞
    • 4.8 实战八 | Smart-seq2 | 人胰腺细胞
    • 4.9 实战九 | 不同技术数据整合 | 人胰腺细胞
    • 4.10 实战十 | CEL-seq | 小鼠造血干细胞
    • 4.11 实战十一 | Smart-seq2 | 小鼠造血干细胞
    • 4.12 实战十二 | 10X | 小鼠嵌合体胚胎
    • 4.13 实战十三 | 10X | 小鼠乳腺上皮细胞
    • 4.14 | 实战十四 | 10X | HCA计划的38万骨髓细胞
  • 5 补充篇:开拓思路
    • 5.1 10X Genomics概述
      • 5.1.1 10X Genomics 问题集锦
    • 5.2 CellRanger篇
      • 5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载
      • 5.2.2 CellRanger实战(二) 使用前注意事项
      • 5.2.3 CellRanger实战(三) 使用初探
      • 5.2.4 CellRanger实战(四)流程概览
      • 5.2.5 CellRanger实战(五) 理解count输出的结果
    • 5.3 Seurat的使用
      • 5.3.1 Seurat V3 | 实战之2700 PBMCs分析
      • 5.3.2 Seurat V3 | 如何改造Seurat包的DoHeatmap函数?
      • 5.3.3 scRNA的3大R包对比
      • 5.3.4 Seurat两种数据比较:integrated vs RNA assay
      • 5.3.5 seurat 的几种findmaker比较
    • 5.4 Monocle的使用
      • 5.4.1 Monocle V3实战
    • 5.5 多个数据集的整合
      • 5.5.1 使用Seurat的merge功能进行整合
      • 5.5.2 如何使用sctransform去除批次效应
由 GitBook 提供支持
在本页

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  1. 5 补充篇:开拓思路
  2. 5.2 CellRanger篇

5.2.1 CellRanger实战(一)数据下载

刘小泽写于19.5.3

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最后更新于4年前

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数据来自2018年9月的NC文章

文章解读在:

实验设计

共有两名患者:

  • 患者2586-4:

    • The primary patient (2586-4) received hypofractionated radiation for HLA upregulation to some but not all disease sites

    • 利用10X 3' Chromium v2.0平台建库 + Hiseq2500 "rapid run"模式

    • discovery tumor部分:After sequence alignment and filtering, 7431 tumor cells (2243 cells before and 5188 cells after T cell therapy)

    • discovery PBMC部分:After sequence alignment and filtering, a total of 12,874 cells were analyzed [其中包含了四个时间点:治疗前(Pre),治疗后早期day +27(Early),治疗后反应期day+37(Resp),治疗后复发+614 (AR)]

    ID

    Description

    Tumor Disc Pre

    Tumor Disc AR

    PBMC Pre

    PBMC Disc Early

    PBMC Disc Resp

    PBMC Disc AR

  • 患者9245-3:

    • The second validation patient (9245-3) is a 59-year-old man with metastatic MCC that had initially presented as stage IIIB disease, now metastatic at multiple sites

    • 利用10X 5' V(D)J 进行cell washing, barcoding and library prep+ NovaSeq 6000(gene expression) + Hiseq4000 (V(D)J)

    ID

    Description

    PBMC Relapse - L001

    PBMC Relapse - L002

    Tumor Relapse - L001

    Tumor Relapse - L002

软件环境

原始数据一般是以SRR格式存放,这个文件一般都要几个G,于是下载器首选ascp,但是直接使用ascp下载又需要配置一些参数,对于新手来说,最好是能提供一个ID,然后直接就下载,这个就需要用到prefetch 与 ascp的组合了

prefetch是sratools中的一个小工具,因此直接用conda下载就好

conda install -c daler sratoolkit
prefetch -h # 可以显示帮助文档就说明安装成功
# 如果要下载数据比如SRR文件,直接加ID号,指定输出目录就好
prefetch SRRxxxxxxx -O PATH

默认情况下,prefetch是利用https方式去下载原始数据,这个就像直接从网页下载一样,速度有一定的限制。因此我们需要先安装一款叫做"aspera"的下载工具,它是IBM旗下的商业高速文件传输软件,与NCBI和EBI有协作合同

wget http://download.asperasoft.com/download/sw/connect/3.7.4/aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
tar zxvf aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
#安装
bash aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.sh
# 然后cd到根目录下看看是不是存在了.aspera文件夹,有的话表示安装成功
cd && ls -a
# 将aspera软件加入环境变量,并激活
echo 'export PATH=~/.aspera/connect/bin:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
# 最后检查ascp是不是能用了
ascp --help

ascp安装成功后,prefetch就会默认将下载方式从https转移到fasp,说明开启加速模式

一般ascp没有什么问题,出问题主要是:

ascp: Failed to open TCP connection for SSH, exiting.

Session Stop  (Error: Failed to open TCP connection for SSH)

# 官网给出的解决办法是:https://support.asperasoft.com/hc/en-us/articles/216126918-Error-44-UDP-session-initiation-fatal-error
On many Linux systems the default firewall can be configured with iptables. You will have to allow all incoming and outgoing traffic on UDP port 33001 (or whatever your Aspera UDP port is), which you can do with the following commands:
# 使用下面这两个命令(但需要管理员权限)
# iptables -I INPUT -p tcp --dport 33001 -j ACCEPT
# iptables -I OUTPUT -p tcp --dport 33001 -j ACCEPT

数据下载

以患者2586-4为例,所有数据都存放在GEO中

  1. 下载代码

    wkd=/home/project/single-cell/MCC
    
    cd $wkd/raw
    # for patient 2586-4
    cat >SRR_Acc_List-2586-4.txt
    SRR7722937
    SRR7722938
    SRR7722939
    SRR7722940
    SRR7722941
    SRR7722942
    
    cat SRR_Acc_List-2586-4.txt |while read i
    do prefetch $i -O `pwd` && echo "** ${i}.sra done **"
    done
    # 一般2.6G文件下载2分钟左右
  2. 下载成功会有提示

    2019-xxxxxxxx prefetch.2.9.1:  fasp download succeed
    2019-xxxxxxxx prefetch.2.9.1: 1) 'SRR7722937' was downloaded successfully
    2019-xxxxxxxx prefetch.2.9.1: 'SRR7722937' has 0 unresolved dependencies
    ** SRR7722937.sra done **

两个患者的十个样本数据下载结束后发现,SRR7722939和SRR7722942下载失败,看了一下数据源,这两个数据在sra-sos.public这个位置,而不是在ncbi

于是,可以选择另一个途径EBI下载

  1. 然后利用这个代码下载

ascp -QT -l 300m -P33001 -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/009/SRR7722939 ./

打开 (这里注意链接是有规律的,只需要改变最后的ID号就能获取其他的GEO数据)

点击SRA这里的SRP155988

send to => Run Selector => Go

下载Accession List,然后就得到了一个文本文件,列出了6个SRR ID号

进入官网 ,搜索想下载的SRA号

选择SRR这里[或者直接通过修改ID]

EBI有个好处就是可以直接下载fastq格式文件(左边方框),如果要下载sra就复制右边红色方框中链接

Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA
https://www.jianshu.com/p/b818e38f7e9c
GSE117988
GSE118056
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117988
https://www.ebi.ac.uk/ena
https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/SRR7722939
GSM3330559
GSM3330560
GSM3330561
GSM3330562
GSM3330563
GSM3330564
GSM3317833
GSM3317834
GSM3317835
GSM3317836